新型 EGFR 小分子抑制剂（克服 L858R/T790M 突变）

目前针对非小细胞肺癌最有效的手段是个体化靶向治疗，常见的靶点有 C-met、ALK 和 EGFR。有研究表明 [1],在非小细胞肺癌患者体内,表皮生长因子受体（EGFR）的突变最为常见，其中约 30%~40% 的亚洲 NSCLC 患者在确诊时携带 EGFR 突变，尤其是无吸烟史的中年女性。因此，EGFR 抑制剂成为肺癌治疗的最大研究热点之一。

目前 EGFR 抑制剂共有四代，其中第一代的代表性抑制剂为吉非替尼和厄洛替尼，第二代的代表性抑制剂为阿法替尼，第三代的代表性抑制剂为 AZD9291 和 CO1686（5），第四代代表性抑制剂为 EAI045 。由于第一代抑制剂出现的耐药性问题,使得以后的抑制剂都在针对耐药基因突变来设计抑制剂结构。主要的耐药突变有 L858R/T790M 双突变和 C797S 。Hao Y 等[2], 针对 EGFR T790M 突变设计了第三代 EGFR 抑制剂。作者将已报道的化合物 5 和化合物 7 进行分子融合和骨架跃迁，获得一系列新骨架类型的 EGFR 三代抑制剂，其中化合物 20g 各方面药理数据最优，其对野生型 EGFR 蛋白的选择性为 263 倍，在细胞中的选择性为 35.5 倍。体内抗肿瘤实验表明，H1975 细胞移植瘤小鼠的肿瘤抑制率为 73.2%，在 A431 细胞移植瘤小鼠的肿瘤抑制率为 37.2%。（图1）

图1 化合物 20g 的设计（图片来源：《J. Med. Chem.》）

化合物 5（CO1686）和化合物 7 是已报道的针对 EGFRL858R/T790M 双突变的三代抑制剂。作者将两个分子与 EGFR 蛋白的结合模式进行叠合，发现它们存在着很多相似的结合模式：1）氨基嘧啶部分可以与蛋白铰链区的 Met793形成两个氢键作用；2）左侧的亲水尾部伸向溶剂区；3）右侧的丙烯酰胺部分与蛋白的 Cys797 形成共价键。此外，由于 EGFR 发生 T790M 突变，诱导蛋白中出现两个口袋（S1 和 S2），其中化合物 5 的三氟甲基占据 S1 口袋，化合物 7 的N-甲基占据 S1 口袋。作者设想通过分子融合和骨架跃迁的策略设计化合物 14a，使其能够同时占据 S1 和 S2 口袋，进一步提高活性和选择性。分子对接结果显示，化合物 14a 在保留了以上相互作用的基础上，R3 位置的甲基可以伸向 S2 口袋，这与他们的设计初衷相符合。（图2）体外酶活性结果显示，化合物 14a 对 EGFRL858R/T790M 和 EGFRWT 的酶活性分别为 46 nM 和180 nM ,选择性仅为 4 倍。细胞实验表明，化合物对 H19751 细胞株（表达EGFR-L858R/T790M ）和 A431 细胞株（过表达 EGFRWT）均活性较弱，IC50 大于 10 μM。随后作者通过在 R3 位置引入取代基来改善化合物的细胞透膜性，以及对伸向溶剂区的部分进行改造，最终获得了选择性高活性好的化合物 20g，其对 EGFRL858R/T790M 和 EGFRWT 的酶活性分别为 0.3 nM 和 79 nM，选择性高达 263 倍。

图2.（A）化合物 5 和 7 的结构；（B）化合物 5 和 7 与 EGFR 蛋白结合的分子叠合图；（C）化合物 14a 与 EGFR 蛋白的分子对接图；（D）新骨架化合物与靶蛋白的 2D 模式图。（图片来源：《J. Med. Chem.》）

Western Blot 实验进一步评价化合物 20g 对 EGFR 信号通路的影响，结果如图3所示，化合物 20g 在 1 nM 浓度下可以抑制 H1975 细胞（表达 EGFR-L858R/T790M ）中 EGFR 蛋白的磷酸化以及下游 AKT 蛋白的磷酸化。而在 A431 细胞株（过表达 EGFRWT）中，只有浓度达到 100 nM 时才对EGFR 和 AKT 的磷酸化产生抑制。这一结果表明，化合物 20g 在细胞水平具有很好的选择性，并且靶向 EGFRL858R/T790M。

图3. Western Blot 实验（图片来源：《J. Med. Chem.》）

体内药效实验表明， 50 mg/kg 口服给药 14天后，化合物 20g 可以显著抑制 H19751 移植瘤小鼠的肿瘤生长，肿瘤抑制率达到 73%，实验前后小鼠体重没有显著影响，证明化合物没有明显的毒性。而对于 A431 移植瘤小鼠模型，50 mg/kg 口服给药 14 天后，化合物 20g 对小鼠肿瘤的抑制率较低。（图4）

图4. 化合物 20g的体内抗肿瘤实验。（图片来源：《J. Med. Chem.》）

小M 的小思考：

随着精准医疗时代的到来，其相比传统诊疗手段具有更高的精准性。人们通过基因测序寻找个体化癌症突变基因，从而迅速确定对症药物。这不仅节约寻找治疗方法的时间，还可以提升治疗效果。 EGFR 突变具有其独特的患病人群，针对这一人群发展靶向 EGFR 突变的药物可以更有效的治疗非小细胞肺癌患者。Hao Y 等通过分子融合和骨架跃迁的方法获得高选择性和高活性的三代EGFR 抑制剂（20g），为治疗非小细胞肺癌患者提供了新的化学实体分子。

参考文献

[1] Hamaguchi R,etal. Effects of anAlkaline Diet on EGFR-TKI Therapy in EGFR Mutation-positive NSCLC. Anticancer Res. 2017Sep;37(9):5141-5145.

[2] Hao Y, et al.Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Pyrimido[4,5- d]pyrimidine-2,4(1 H,3 H)-diones as Potent and SelectiveEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Inhibitors against L858R/T790M Resistance Mutation. JMed Chem. 2018

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