好吧，这是本周(2016.10.21-28)的学习任务之一：安装bowtie2并学习其使用方法&参数设置

所以，啃文档咯，官方文档Version 2.2.9 http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml

以下是我的整理。我不生产文档，我只是文档的搬运工么么哒～

Bowtie2适合将长度50-1000bp的reads比对到长的参考序列上。Bowtie 2 indexes the genome with an FM Index
(based on the Burrows-Wheeler Transform or BWT) 。输出结果为SAM格式。已集成在很多软件中，如
TopHat(a fast splice junction mapper for RNA-seq reads)，
Cufflinks(transcriptome assembly and isoform quantitiation from RNA-seq reads)，
Crossbow( cloud-enabled tool for analyzing reseuqncing data),
Myrna(a cloud-enabled tool for aligning RNA-seq reads and measuring differential gene expression)。

Bowtie1和2的区别：Bowtie 2's command-line arguments and genome index format are both different from Bowtie 1's.
1，bowtie1出现的早，所以对于测序长度在50bp以下的序列效果不错，而bowtie2在长度在50bp以上的更好。
2，Bowtie 2支持有空位的比对Number of gaps and gap lengths are not restricted, except by way of the configurable scoring scheme.
3，Bowtie 2支持局部比对(local, some chars will be omited/trimmed)，也可以全局比对(end-to-end, all char participate)
4，Bowtie 2对最长序列没有要求，但是Bowtie 1最长不能超过1000bp。
5. Bowtie 2 allows alignments to [overlap ambiguous characters] (e.g. `N`s) in the reference. Bowtie 1 does not.
6，Bowtie 2不能比对colorspace reads.
7, Bowtie 2's paired-end alignment is more flexible. Try to find unpaired alignments for each mate。
8, Bowtie 2 reports a spectrum of mapping qualities, Bowtie 1 reports either 0 or high。

MUMmer: align 2 very large sequences(eg: 2 genomes)
NUCmer, BLAT/BLAST, Bowtie2: sensitive alignment to short ref seq(eg: a bacterial genome)

安装bowtie2: 直接下载bowtie2-2.2.9-linux-x86_64.zip，解压，修改环境路径即可

（设置环境路径请自行百度，或者参考这个http://www.cnblogs.com/pxy7896/p/5886305.html）

Scores: 更高分=更相似
--ma :match bonus
--mp :mismatch penalty
--np :penality for having N in either the read or the ref
--rdg :affine read gap penalty
--rfg :affine ref gap penalty
全局比对栗子：默认，高质量位点的mismatch罚分为-6，长度为2的gap罚分为-11(gap open-5, extension-3)，如果在长度为50的read中只有这两个问题，则总分为-17。所以，最好的分数是0，指read和ref完全相同。
default min score threshold:
可以用--score-min设置
-0.6-0.6*L（read长度）
局部比对栗子：罚分同上，但每个match获得bonus,+2，则如果是上面情况，则得分为2*49-6-11=81
default min score threshold:
20+8*ln(L)（read长度）

paired-end read:两个mate的分数相加

Mapping quality:higher=more unique
如果一个read来自重复区域，则可能map到多个地方，所以需要知道比对的可信程度。在SAM文件中，MAPQ就是这个，值为Q=-10log10p。p是对比对错误的概率的估计。一个read越特殊，比对错误的概率越小，Q值越大。

bowtie2是对paired read的每个mate分别比对的，所以如果两个比对结果不符合预期(比如方向不合适或者距离不合适)，就说是align discordantly，这种在研究structural variants时有用。
--ff --fr --rf: expected relative orientation of the mates
-I and -X: expected range of inter-mates distances
--no-discordant: 禁止找discordant alignments
--no-mixed: mixed mode指对一个pair找不到paired-end alignment时，为每个mate找unpaired alignments。关了这个会快一点点。

SAM 格式中有一些flag和optional fields描述了paired-end特征

Mates can overlap, contain, or dovetail each other

overlap:

contain: mate2刚好是mate1的子序列

dovetail: 咬合，延长

bowtie2默认overlap和contain是concordant的，dovetai是disconcordant的。所以：
--no-overlap和--no-contain使得这两种情况变为disconcordant
--dovetail: 让dovetail变为concordant

Reporting mode:
dafault mode: 找多个匹配，报告最好的
-D和-R: 会使程序变慢，但是增大了找到最好比对的可能性(针对有多个比对的)
-k mode: 找一个或多个匹配，全报告
-k N找最多N个匹配，按比对分数降序排序
-a mode: 找和报告所有的。对大基因组，这个会很慢。

bowtie2找匹配时采用随机的策略，会使用--seed产生随机数来选择需要报告的匹配。所以如果使用

--non-deterministic，则对同样的输入reads，可能会产生不同的比对结果输出。
To rapidly narrow the number of possible alignments that must be considered, Bowtie 2 begins by

extracting substrings ("seeds") from the read and its reverse complement and aligning them in an

ungapped fashion with the help of the FM Index.
-L: seed length
-i: interval between extracted seeds
-N: # mismatches permitted per seed
如果想要更sensitive的比对，可以减小L和i，增大N。同样，-D和-R也与此相关。

--n-ceil: upper limit on # N if valid

Presets: setting many settings at once

--very-sensitive: 等价于-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50 //可以查看文档得知

过滤：
bowtie2会在SAM记录里写出低质量read，YF:i SAM optional field 也会解释过滤它们的原因（多个原因只说一个），但是不会去比对它们。
YF:Z:LN read长度<=seed mismatches(-N)
YF:Z:NS read里N的数量>(--n-ceil)
YF:Z:SC 低于--score-min
YF:Z:QC 与--qv-filter设定相关。Illumina的QSEQ格式中，read最后一个域含1

small(32-bit numbers, for <4 billion nucleotides in length, index.bt2) and large(64-bit numbers, .bt21) index自动选择，无需担心
Performance tuning:
-p: 多线程
-o/--offrate: 使用bowtie2-build时，这个值比default设得小些。这样会有更大的index，适合-k和-a模式（报告多个比对的）。但如果计算机内存小，还是把这个值设大，减少内存消耗。

×××××××××××××××××××××××××××××××××××××××实验×××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××

Step 1：建索引

新建文件夹，在新文件夹下运行,

bowtie2-build /home/pxy7896/Downloads/bowtie2/example/reference/lambda_virus.fa lambda_virus

结果：产生六个文件。（eg1,eg2,eg3是后面的）

可以使用预先建好的索引。

可以一次为多个文件建立索引，文件名之间用,分隔

Step 2: 比对reads

bowtie2 -x lambda_virus -U /home/pxy7896/Downloads/bowtie2/example/reads/reads_1.fq -S eg1.sam

参数解释：

-x: 查看index文件首先在当前目录下找，找不到再去环境变量BOWTIE2_INDEXES下找。

-U: 后面跟需要比对的read文件。多个用,分隔。

-S: 后跟结果文件的名字。

比对结果写到eg1.sam，要查看：head eg1.sam

sam格式：(haven’t read yet)

Step 3: 比对paired-end reads

bowtie2 -x lambda_virus -1 /home/pxy7896/Downloads/bowtie2/example/reads/reads_1.fq -2 /home/pxy7896/Downloads/bowtie2/example/reads/reads_2.fq -S eg2.sam

Step 4: long reads local alignment

bowtie2 --local -x lambda_virus -U /home/pxy7896/Downloads/bowtie2/example/reads/longreads.fq -S eg3.sam

samtools:（可以输入命令，查询可以选择的参数）

Step 5: sam转为bam格式 (binary format of sam)

samtools view -b /home/pxy7896/Desktop/eg/eg2.sam -o eg2.bam

Step 6: sam排序为.sorted文件(这是压缩了的文件，适合存储)

samtools sort eg2.bam -o eg2.sorted

Step 7: generate variant calls in VCF format

发现居然没有装bcftools(for calling variants and manipulating VCF and BCF files)

sudo apt install bcftools

然后执行

samtools mpileup -v -u -f $BT2_HOME/example/reference/lambda_virus.fa eg2.sorted | bcftools view -o eg2.raw.bcf

解释：将eg2.sorted和参考序列放一起比对，然后用bcftools将结果放到eg2.raw.bcf中

很奇怪，手册里的命令我运行的不对。。。可能还是这样找使用方法靠谱一点。

产生eg2.raw.bcf文件，大概长这个样子：

×××××××××××××××××××××××××××××××××××××××参数×××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××

bowtie2 

bowtie2-build(关于目录建立)

bowtie2-inspect