99mtc:锝99m同位素-小分子/抗体/纳米粒子等材料放射性标记材料标记实验的设计原则

99mtc:锝99m同位素-小分子/抗体/纳米粒子等材料放射性标记材料

标记实验的设计原则

设计一个放射性同位素的标记实验应从实验的目的性，实验所具备的条件和对放射性的防护水平三方面着手考虑。原则上必须从两个主要方面来设计放射性标记实验：一是必须寻求有效的、可重复的测定放射性强度的条件，二是必须选择一个合适的比活度 λqδ（单位是原子/时间/分子，dpm/mol或ci/mol）。其中，λ=-dN’dt/N’为该处放射性原子核的衰变常数。q=N ’/n’，表示 n’ 个该化学形式分子为N’个放射性原子所标记。δ=n’/n 表示放射性标记的分子数 n’ 与总分子数（标记的加未标记的）n 之比。采用放射性同位素标记技术来实现所研究课题预期目的全部或一部分，一般须经过实验准备阶段，实验阶段和放射性废物处理三个步骤。

（一）实验准备阶段

1、标记剂的选择

选定放射性标记剂的比活度 λqδ 的值必须足够大，以保证实验所需要的灵敏度，而又要尽可能地小，使得在该实验条件下辐射自分解可忽略。一般情形是根据实验目的和实验周期长短，来选择具有合适的衰变方式，辐射类型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。如今已确定的放射性核素包括天然的 58 种和人工制造的约 1300 种，其中大多数不常能用作放射性标记剂。主要原因是制备困难、半衰期不合适及放射性不足以定量。在任何一种生产方法中，生产步骤很可能包含或多或少的化学处理，因而标记实验人员需要了解某个核素及其周围的那些元素的化学性质，因为它们有可能成为此放射性同位素的杂质。

放射性同位素都衰变（经过或不经过中间状态）到处于基态的子体核素，衰变时伴随各种形式的能量辐射，如 α、β-、β+、γ、X 放射等。在选择标记剂时，标记实验人员要仔细研究衰变纲图，根据实验条件和计数条件来决定那一种辐射，在衰变纲变内，代表核能级的两条水平线之间和距离表示能量差，↑ 或 ↓ 表示能级同伴随原子序数增或减少的能量，↓ 表示从激发态至基态的同质异能跃迁。一般要选择较适宜的半衰期 τ 的放射性同位素，使 τ 足够长，从而使衰变校正有意义或干脆不必作衰变校正，同时又要足够短，能较安全地进行标记实验，并使得放射性废物容易处理，在实际工作中，使用的放射性同位素的半衰期应该与实验需要持续的时间 t 相适应，如对于某个实验，t/τ=0.04 时，应所选放射性同位素的衰变校正为 3.5%；而 t/τ=0.10 时，应选放射性同位素的衰变校正为 6.6%。t/τ=0.15 时，应选用其衰变校正为 10%。

在体外标记条件，一般选用半衰期较长而射线强度适中，既利于探测，又易于防护和保存的放射性标记剂。体内标记条件下，若实验周期短，应选用半衰期短，且能放出一定强度 r 射线物放射性同位素，若实验周期长，如需要将动物活杀后对组织脏器分别测定的，则应选用半衰期较长放射性同位素。此外，根据实验目的来选用定位的或不定位的标记标记剂，例如研究氨基酸的脱羧反应，14C 应标记在羧基上，只有这种定位标记的氨基酸，才能在脱羧后产生 14CO2。而有些实验不要求特定位置标记，只须均匀标记即可。

选择放射性标记剂还必须同时满足高化学纯度，高放射性核纯度的要求。在标记剂制备期间、贮存期间以用试验体系中所使用的溶剂、化学试剂、酶等可能会产生化学杂质、放射化学杂质及辐射自分解引起的放射性杂质，这些杂质的存在，使得标记实验中使用的标记剂不“纯”，而或多或少影响实验的结果，甚至会导致错误结论。氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧啶核苷（3H－UR）是两种常用的标记剂，前者有效地结合到DNA中，后者则掺入到RNA中，它们的辐射分解速度随比较放射性的增高及保存时间的延长而增加，在不同温度和不同溶液中的稳定性也不同。经保存八年的 3H-TdR 约有 35% 辐射分解为 3H－胸腺嘧啶，并导致二醇和水合物的形式，在实验中这杂质会很快掺入细胞并与大分子（很可能是蛋白质）结合，而不是与 DNA 和 RNA 相结合，这些杂质用 DNA 酶和 RNA 酶处理细胞都不除去。3H－TdR和3H－UR 贮存在 -20℃ 的冷冻溶液中辐射分离速度要比 +2℃ 增加 3~4 倍，但低温度（-140℃）对贮存也有利，在允许对标记实验人员在选择保存放射性标记剂时会有所启发。

2、放射性同位素测量方法的选择

测量方法的选择取决于射线种类，对于α射线通常可用硫化锌晶体、电离室、核乳胶等方法探测；对能量高的 β射线可用云母窗计数管、塑料闪烁晶体及核乳胶测定，对于能量低的β射线可用液体闪烁计数器测量：对于 γ射线则用 G-M 计数管，碘化钠（铊）闪烁晶体探测。日前大多数实验室主要采用晶体闪烁计数法和液体闪烁计数法两种测量方式。

同一台探测仪器对不同量的标记剂具有不同的较佳工作条件，在实验准备阶段要检查探测器是否已调有所用标记同位素的工作条件，否则需要用一定量的标记剂作为放射源（或选用该同位素的标准源），把探测器的较佳工作条件调整好，并且要保证探测器性能处于稳定可靠的状态。

探测较佳工作条件的选择方法：一种是测“坪曲线”，另一种是找较好的品质因素。对于光电倍增管，在理论上不存在“坪”（plateau）。但随着高压的增加，在一定范围内，脉冲数变化较小，形成一段坡度较小的电压脉冲曲线，通常也称其为坪。测坪曲线的方法：固定放射源，根据其射线能量的大小，初选一个广大器增益（放大倍数）和甄别器阈值。不断地改变高压（由低到高，均匀增加伏度），每改变一次高压，都测定一次本底和放射源的计数率，较后作出高压本底计数率和高压放射源计数曲线。用同样的方法，作另一个甄别阈值（放大倍数不变）下的高压计数率曲线，这样反复多作几条曲线。必要时，还可固定甄别阈值，改变放大倍数，求出高压计数率曲线。应选择“坪”比较平坦的曲线工作条件：甄别阈值和放大增益，作为正式测定时间的仪器工作条件，高压值应选择在该“坪”中点偏向起始段一边相应的高压值。品质因素，又称为优值，是指在一定条件下，要达到合适的统计数目所需要的时间是仪器的计数效率E和本底计数Nb的函数：品质因素 F=E2/Nb 它是衡量一台计数器性能的指标，仪器的品质因素F应该越大越好，品质因素F越大，表示测量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性标记的标准源存在来源困难等问题的话，可以用相对品质因素f来代替。相品质因素 f=ns/nb 式中ns指某种放射性样品的计数率。找较好品质因素的方法与测坪曲线一样，作出几条高压－F（或 f）的关系曲线，在几条曲线中选择峰值较高的曲线。这根曲线的峰值所对应的条件：高压，甄别阈，放大倍数等，就是该仪器对被测同位素的较佳工作条件。较佳品质因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的却在“坪”的下端。着眼于把同位素的整个能谱峰都计下来的标记实验者主张取“坪”所对应的工作条件，而着眼于优值者，主张取较佳品质因素所对应的工作条件，也有人折衷。如果某仪器本底很低，光电倍增管噪音很低和能谱分辩高，二者应该相差不大。同一台仪器的较佳工作条件，随仪器的使用期延长而有所改变，不同的放射性同位素，其较佳工作条件不同。因此核探测仪器的较佳工作条件具有专属性，并且要经常通过选择其不同时期的较佳工作条件。更不能不问被测同位素的种类，而千篇一律地使用同一个工作条件。

为了达到准确地计数，可以长时间一次计数，或短时间多次测量，两者达到的标准误基本相同，为避免外界因素的影响，在实际工作中，取短时间多次测量较为合理适用。在测量样品的放射性时，本底是一个重要影响因素。本底高，则标准误和标准误差都增大，尤其在样品计数较低时，本底对标准误和标准误差的影响就愈大，从而影响实验结果的精度，而且为了达到一定的精度，势别要增加样品的测量时间。根据核衰变的统计规律，在实验中如果样品数量少，选择 tN=1.4tb 的比例（式中tN为样品放射性测量时间，tb 为本底测量时间）较为合理；如果样品数量较多是一大批样品，则延长本底测量时间 tb，取 tb 的时间均值，而 tN 则可相对短，这样可节省时间，有利于缩短实验周期。对于标记实验设计来说，样品中所含放射性强度的要求，是使其放射性计数率大于或等于本底计数的 10－20 倍。

3、进行非放射性的模拟实验，把实验全过程预演一遍

同位素标记实验要求准确、仔细，稍有疏忽或考虑不周就匆忙进行正式实验，既容易导致实验失败，又会造成标记剂和其它实验用品的浪费，还会增加放射性废物，增加实验室本底水平，使实验者接受不必要的辐射剂量，所以模拟实验不仅可以检查正式实验中所用器材，药品是否合格，又可以操作人员进行训练，以保证正式实验能顺利进行。

（二）正式实验阶段

1、选择放射性同位素的剂量

同位素必须能经得起稀释，使其较后样品的放射性不能低于本底，一般来说放射性同位素在生物体内不是完全均匀地被稀释，可能在某些器官、组织、细胞、某些分子中有选择性地蓄积，蓄积的部分放射性就会很强，在这种情况下，应以相关部位对标记剂的蓄积率来考虑标记剂用量。在细胞培养，切片保温，酶反应等标记实验中，应依据实验目的、反应时间及反应体积的不同来考虑标记剂的用量，通常小于一个微居里或几个微居里。由于放射性同位素存在辐射效应，应该根据使用的放射性核素的种类，将用量控制在较大允许剂量之内（maximun permissible dose），以免因剂量过大所造成的辐射效应，给实验带来较大的误差。

2、选择标记剂给入途径

整体标记实验时，应根据实验目的，选择易吸收、易操作的给入途径，一般给予的数量体积小，要求给予的剂量准确，防止可能的损失和不必要的污染。体外标记实验时，应根据实验设计的实验步骤的某个环节加入一定剂量的标记到反应系统中去，力求操作准确，仔细。

3、放射性生物样品的制备

根据实验目的和标记剂的标记放射性同位素的性质制备放射性生物样品，其中放射性同位素的性质是生物样品制备形式的主要依据。若是释放r射线的标记剂，则样品制备比较容易，只要定量地取出被测物放入井型 NaI（TL）晶体内就能测定；若是释放出硬 β 射线的标记剂，须将生物样品制成厚度较薄的液体，或将液体铺样后烘干，也可灰化后铺样，放入塑料晶体闪烁仪内测定，或用钟罩型盖一革计数管探测；若标记同位素仅释放软β射线，那么样品应制成液体闪烁样品（详见放射性测量一章），在液体闪烁计数器内测量。不论采用何种测量方法，都应该对样品作定量采集。对某些放射性分散的样品，应当作适当浓集，如测定组织内蛋白质的放射性，应对蛋白质作提取处理然后制备成相应的测量样品。有些样品需采用灰化法，但灰化法对易挥发的同位素或易挥发的组织样品不合适。

4、放射性样品的测量

测量方法分为绝对测量和相对测量。绝对测量是对样品的实有放射性强度作测量，求出样品中标记同位素的实际衰变率，在作绝对测量时，要纠正一些因素对测量结果的影响，这些因素包括仪器探头对于放射源的相对立体角、射线被探头接收后被计数的几率、反散射、放射源的自吸收影响等等。而相对测量只是在某个固定的探测仪器上作放射性强度的相对测量，不追求它的实际衰变率。在一般的标记实验中，大多采用相对测量的方法，比较样品间的差异。在相对测量时，要注意保持样品与探测器之间的几何位置固定。几何条件的影响是放射性测量中较重要的影响因素。当两个放射性强度相同的样品在测量中所置的几何位置不一，或样品制备过程造成的几何条件差异，其计数会相差很多，尤其当样品与探头之间距离较近时，两者计数率相差会很大。但是当样品与探头之间相距较远时，由于样品与探头之间形成的相对立体角较小，所以两者计数率的差异会显著减小。在用纸片法测量 3H 标记物的放射性强度时，要注意纸片在闪烁瓶中的位置，一批样品应该一致，如果是将滤纸剪成圆状作支持物，圆片的直径较好与闪烁瓶底的直径相等，保证滤纸在闪烁瓶内的位置固定。减小几何条件对放射性测量的影响可以从三方面入手：（1）选择探测窗大的探测器，如光电倍增管作探头的探测器；（2）在样品制备时，注意尽量将样品做成点状源，这样当样品的放射性强度较弱时，由于距离探测窗较近而有可能造成的水平位移的影响就可以忽略；（3）无论样品距离探测窗远近，样品都应置于探测窗的垂直轴线上，以减少样品与探测窗之间的相对立体角。

（三）放射性去污染和放射性废物处理

放射性实验，无论是每次实验或阶段性实验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，因此，在实验结束后，要作去污染处理和放射性废物处理。必要时在实验过程进行中，就要作除污染和清理放射性废物的工作。

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