引物的合成和纯化知识详解

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，由待合成引物的3’端向5’端合成延伸，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。

固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：

1) 用三氯乙酸去除固相载体5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；
2) 将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5′-羟基发生缩合反应；
3) 由于无法保证百分之百的5′-羟基都参与缩合，可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；
4) 在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基连接完成。合成过程中可以监控脱下的保护基团DMT的颜色可以初步判定合成效率。

2. DNA合成粗产物中含有什么杂质？

主要是合成过程中产生的少量失败片段。

3. 引物纯化方式有哪些？

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