受激发射损耗显微术（一）
受激发射损耗显微术（一）
1、STED原理
在 STED 显微术中，有效荧光发光面积的减小是通过受激发射效应来实现的。一个典型的 STED 显微系统中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。当激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。由此，有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的分辨率。
STED 显微术能实现超分辨的另一个关键在于受激发射与自发荧光相互竞争中的非线性效应。当损耗光照射在激发光斑的边缘位置使得该处样品中的电子发生受激发射作用时，部分电子不可避免地仍然会以自发荧光的方式回到基态。然而当损耗光的强度超过某一阈值之后，受激发射过程将出现饱和，此时以受激发射方式回到基态的电子将占绝大多数，而以自发荧光方式回到基态的电子则可以忽略不计。因此，通过增大损耗光的强度，使得激发光斑范围内更多范围的自发荧光被抑制，可以提高 STED 显微术的分辨率。
1）损耗光斑的调制
为了减小有效荧光的发光面积，需要使得经显微物镜聚焦后所得的损耗光斑的光强分布满足以下特性: 在激发光斑的边缘部分具有较大的光强抑制自发荧光的产生，同时在激发光斑的中心部分具有趋近于零的低光强，对自发荧光不产生影响。
通过采用一块 0/π 位相板（如图（b）所示）对损耗光束进行相位调制，可以使得经显微物镜聚焦之后的损耗光斑呈现轴向中空型。此时，焦面前后位置的样品由于受到较强的损耗光强照射，自发荧光得到抑制，而焦面附近的样品在接近于零的损耗光强下自发荧光不受影响。因此，通过这种方式对损耗光斑进行调制，可以较为显著地提高轴向分辨率。
当一束线偏振光通过( 如图2© 所示) 0 /π 位相板进行相位调制之后，其聚焦所得光斑将在横向上被一条暗线分割成两瓣，暗线的方向与所用 0 /π 位相板的位相分割线方向一致。值得注意的是，所用线偏振光的偏振方向也应与所用 0 /π 位相板的位相分割线方向一致。因此，通过对损耗光进行偏振和相位调制，可以在与暗线垂直的方向上实现横向一维超分辨。进一步地，如果将损耗光束分成两路，分别用两块位相分割线方向相互垂直的 0 /π 位相板对两个光路进行调制，最后两光路所形成的损耗光斑在样品上叠加可以实现横向二维超分辨。
当一束圆偏振光经过 0～2π 涡旋位相调制后，其聚焦光斑将 呈 现 为 面 包 圈 型(如图2(d) 所示) 。采用这种方法生成的面包圈型中空损耗光斑可以很好地应用于 STED 系统之中，实现超衍射极限的分辨率。
2）激发光与损耗光激光类型的选择
目前可用于 STED 系统的激光光源类型组合为: (1) 脉冲激发光和脉冲损耗光; (2) 脉冲激发 光 和 连 续 损 耗 光; (3) 连 续 激 发光和连续损耗光。
3）激发光与损耗光波长的选择
需要满足以下原则: 激发波长应选在所用荧光粉激发谱的峰值波长附近，以保证较好的吸收; 损耗光波长应选在所用荧光粉发射谱的长波拖尾处，以避免损耗光对样品的二次激发。然而在这种波长选择方法下，损耗光波长处的受激发射截面 σ 较小，使得相应的阈值光强 Is较大，从而导致了所需的损耗光强很高，对样品的漂白较为严重。
另外两种消除损耗光激发荧光所带来的干扰的方法被研究人员们提出。在第一种方法中，先只开启损耗光源，探测损耗光斑在样品上激发出的荧光光强，之后同时开启激发光源和损耗光源，进行常规 STED 成像，最后在 STED 所得图像中减去损耗光激发的荧光光强得到最终图像。第二种方法主要基于频率探测原理，对激发光按一定频率进行调制而不对损耗光进行调制，利用锁相放大器提取所调制频率的荧光分量即可排 除损耗光激发的影响。虽然这两种方法均已在实验中证明了可行性，但是目前的发展及应用都还不成熟。
2、STED技术的改进
1）STED三维超分辨显微的实现
目前比较主流的三维 STED 超分辨实现方法主要有两种。第一种方法将上面所述的两种损耗光调制方法进行结合，通过将损耗光分成两路分别用图 2(b) 所示的0/π 位相板和图 2(d) 所示的 0～2π涡旋位相板进行相位调制，最后使两路经不同相位
调制之后的损耗光在样品处通过光强的非相干叠加生成一 个 三维的中空型光斑，具体如图所示。
第二种 方 法 则 是 主 要 基 于 4pi 显 微 镜 的 架构，在样品的两侧分别放置一个显微物镜，通过对向照明、对向接收的方式来实现三维超分辨。具体方法如图 所示，损耗光光路仍然分为两路，其中一路通过一个 0～2π 涡旋位相板进行相位调制，用以生成横向空心光斑，另外一路损耗光则不通过任何位相板作相位调制。利用光路中的半波片( H1，H2) 和偏振分光棱镜( PBS) 对入射到两个显微物镜的光束的偏振进行调制，使得入射到两个显微物镜上的两路相位调制光束的偏振方向相同，从而在样品上发生相长干涉，使得生成的横向空心光斑尺寸更小; 同时通过偏振调制使得入射到两个显微物镜上的两路相位未调制光束的偏振方向相差 180°，从而在样品上发生相消干涉，生成一个轴向空心光斑。横向空心光斑和轴向空心光斑在样品上通过光强非相干 叠 加 生 成 三 维 空 心 光 斑，用 以 STED 三 维 超分辨。
以上两种 STED 三维超分辨的实现方案均有各自的优点和不足。第一种方法的装置比较简单，光路校准也较为容易，但是在轴向上的分辨率要比横向上差很多( 典型值为横向分辨率 45 nm，轴向分辨率 108 nm) ; 第二种方法可以生成一个近似于球型的空心光斑，从而保证了三维分辨率的各向同性( 横向与轴向分辨率均在 40 ～ 45 nm 左右) ，但是这种方法由于用到了两个显微物镜，光路的校准非常困难，同时系统造价也很昂贵。
2）STED 显微术分辨率的提高
从理论上来说，只要不断地提高损耗光的光强，STED 可以实现的空间分辨率是没有极限的。然而在实际实验当中，损耗光斑的质量，荧光样品的漂白，光路校准上的误差等因素都会限制 STED的分辨率。因此，一般典型的 STED 显微系统的分辨率在 50 nm 左右。
一种可行的提高 STED 显微分辨率的途径为改进样品的制备方法，尽可能地提高样品的抗漂白性，从而提高 可 用 于 样 品 成 像 的 损 耗 光 强。2009 年， S.W.Hell等人利用氮缺位( NV) 样品( 不会漂白) 实现了 5.8 nm 的 横 向 分 辨 率。另 一 种 提 高 STED分辨率的方法则是通过提高显微物镜的数值孔径来实现。2012 年，S.W.Hell 小组利用固态浸没技术( NA = 2.2) 实现了 2.4 nm 的横向分辨率，这也是至今有报道的 STED 显微可实现的最高分辨率。
3）损耗光功率的降低
较强的损耗光强不仅会增大功耗，同时也会对荧光样品造成光漂白和光毒害。
为了降低损耗光的光强，研究人员们在 STED 中引入了时间门探测技术( Time gated detection) ，提出了 G-STED( Gated-STED) 。在 STED 显 微 技 术 之中，位于激发光斑边缘位置的荧光粉虽然会在高强度损耗光的作用下发生受激发射作用，但是仍然会有少量电子不可避免地通过自发荧光的方式回到基态。研究人员们发现，如果可以排除这部分自发荧光对成像结果的影响，STED 的分辨率可以进一步地提高。同时，研 究 人 员 们 还 发 现，在 损 耗 光 的 照 射下，荧光的寿命会发生变化。损耗光强越强，荧光的寿命越短。因此，激发光斑边缘位置的自发荧光寿命将小 于 激 发 光 斑 中 心 位 置 的 自 发 荧 光 寿 命。G- STED 正是基于这一原理，通过延时探测的方式( 在激发光作用后，隔一段时间再对荧光进行探测) ，去除掉了激发光斑边缘位置的短寿命自发荧光对成像结果的影 响，提 高 了 系 统 的 分 辨 率。换句话说，G-STED 可以在较低的损耗光强下实现与常规 STED 相同的分辨率。需要注意的是，要实现 G-STED 技术，激发光必须为脉冲光而损耗光必须为连续光。实验表明，脉冲型的损耗 光 作 G-STED 将 不 能 提 高 STED 的 分辨率，无法起到降低所需损耗光功率的作用。
4）STED 显微术成像深度的突破
一般典型的 STED 显微系统只能适用于对比较薄的样品( 一般在几个微米) 进行探测。
其中第一种方法是采用双光子激发来代替常规 STED 系统中的单光子激发方式。在双光子激发方式中，荧光粉中处于基态的电子吸收两个激发光子后跃迁到激发态，之后再通过自发辐射荧光的方式回到基态。由于双光子激发方式中所用的激发光一般为近红外光，穿透能力较强，因此通过将双光子激发和 TED显微相结合的方法可以在较深的成像深度实现超分辨显微。
另一种提高 STED 成像深度的方法则是基于自适应光学的原理。光束在厚 样 品 中 传 播 时 会 受到 散 射 和 像 差 的 影 响 使 得 所 成 的 损 耗 光 斑 质 量 很差，从而限制了成像深度。本方法采用空间光调制器代替涡旋位相板对损耗光进行位相编码，通过评价函数对所得 STED 图像的质量进行实时的监控，同时反馈给空间光调制器对损耗光的位相进行补偿。如此反复，以保证系统中所成损耗光斑的质量。此种方法已经在实验中被证明可以实现 55 μm 的成像深度。
5）双色及多色 STED 显微成像的实现
在 STED 系统中要实现双色成像一般需要用到四束光，其中两束激发光，另外两束为损耗光，激发光和损耗光两两组合对一种荧光粉进行激发和受激发射损耗。在光路的探测部分，使用一个二色镜将样品发出的荧光分成两部分，分别用两个探测器进行收集。采用这种方式虽然可以实现较好的双色成像效果，但是由于系统中涉及到 4 束光，不仅造价昂贵，而且光路校准非常复杂。
为了简 化 系 统，降 低 成 本，研 究 人 员 们 于 2011 年提出了仅用两束光来实现双色 STED 的方法。在这种方法中，样品中标记的两种荧光粉均被同一束激发光所激发，又由同一束损耗光通过受激发射进行消光。由于两种荧光粉的发射谱不可避免地存在交叠，因此需要对两个探测器中探测得到的信号进行去串扰处理。具体方法为在开始成像之前，先通过预实验或对两种荧光粉的发射谱进行积分的方法确定每个探测通道中两种荧光粉所发出荧光所占的比例。利用这一系数矩阵，对成像过程中两个探测器探测得到的信号进行数学线性运算，便可以恢复得出真正有效的信号值。利用这一方法，研究人员们在STED 双色成像中成功实现了 60 nm 左右的分辨率。
采用光激活的方式也可以实现 STED 双色成像。研究人员们发现，两类特殊的绿色荧光蛋白质: Dron-pa 和 Padron 存在光激活特性: Dronpa 在 405 nm 激光的照 射 下 被 激 活，此时可以被激发出 荧 光，而 在488 nm的荧光照射下则会失活，此时无法被激发出荧光; Padron 的光激活特性则和 Dronpa 正好相反，它 被 488 nm 的激光激活，而在 405 nm 激光的照射下则会失活 。基于这一光激活特性，研究人员们采用 405 nm 的激光对两种荧光蛋白质的开关 进 行 切 换，同 时 以 488 nm 的 光 作 为 激 发 光， 595 nm的光作为损耗光实现了 对于活体细胞的STED 双色成像。
STED 双色成像还可以利用两种寿命不同的荧光粉来实现。利用单光子计数技术，对到达探测器的光子的寿命分布进行双指数拟合，便可以确定两种荧光粉所发出的光子在探测器中的具体比例，从而实现双色成像。将寿命双色成像法和之前介绍的基于发 射 光 谱 的 双 色 成 像 法 相 结 合，还 可 以 实 现STED 多色成像。
参考文献
[1]李帅, 匡翠方, 丁志华,等. 受激发射损耗显微术(STED)的机理及进展研究[J]. 激光生物学报, 2013, 22(002):103-113.
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