MISA，英文全称为MIcroSAtellite identification tool，即微卫星识别工具。

MISA是使用 perl 编写的一支程序，能识别出序列中的微卫星和复合微卫星(两个微卫星之间由由不多于100bp的碱基对隔开)，并给出其所在位点。

MISA用法：

$ misa.pl filename

misa.pl

其中，fastfile是序列文件，同时在运行程序的工作目录下必须有一个名称为“misa.ini”

的文件。该文件内容为：

definition(unit_size,min_repeats): 1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5

interruptions(max_difference_for_2_SSRs): 100

该文件指定了misa的参数，即1个碱基重复10次及10次以上；2个碱基重复6次及6 次以上；

3个碱基重复5次及5次以上；4个碱基重复5次及5次以上；5个碱基重复5 次及5次以上；6碱

基重复5次及5次以上，这样的碱基重复序列才算是微卫星序列。 同时，两个微卫星之间的距

离小于100bp的时候，两个微卫星组成一个复合微卫星。

MISA的输出结果：

MISA会在 Fastafile 所在的文件夹下生成两个文件，分别是 “.misa” 和 “.statistics”

".misa" ：以表格的形式列出微卫星的类型和位点；

".statistics" ：统计微卫星的类型和频数。

在MISA的下载页面中，提供了3个附加的 perl 脚本，分别是：Get_est_trimmer.pl，p3_in.pl 和 p3_out.pl。

由于MISA程序读取fasta文件中的序列ID，将序列ID中的空格用下划线 ”_” 填补了，所以在fasta文件中，其序列ID最好不要有空格。否则运行接下来的程序时，会出问题。

Get_est_trimmer.pl

针对EST序列，可以除去EST序列中短的序列和两端不明确的碱基。

p3_in.pl

输入 misa.pl 的输出结果，将引物设计的参数文件(模板，产物长度，目标区域等)导入到一个以“p3in”为后缀的文件中。

$ p3_in.pl filename.misa

调用 primer3_core

该软件详细解说见：http://www.hzaumycology.com/chenlianfu_blog/?p=284，生成结果文件 filename.p3in。使用primer3-2.3.5版本的时候，MISA官网提供的p3_in.pl的结果不符合primer3-2.3.5的输入格式，故需要修改p3_in.pl和p3_out.pl文件。

$ primer3_core -default_version=1 -output=filename.p3out filename.p3in

p3_out.pl

对primer3产生的文件进行提取合，得到最后的结果文件 filename.result

$ p3_out.pl filename.p3out filename.misa

p3_in.pl 和 p3_out.pl 这两支程序需要修改才能正常使用。

结果文件示例

ID      SSR nr. SSR type        SSR     size    start   end     FORWARD PRIMER1 (5'-3') Tm(°C)  size    REVERSE PRIMER1 (5'-3') Tm(°C)  size    PRODUCT1 size (bp)      start (bp)      end (bp)        FORWARD PRIMER2 (5'-3') Tm(°C)  size    REVERSE PRIMER2 (5'-3') Tm(°C)  size    PRODUCT2 size (bp)      start (bp)      end (bp)        FORWARD PRIMER3 (5'-3') Tm(°C)  size    REVERSE PRIMER3 (5'-3') Tm(°C)  size    PRODUCT3 size (bp)      start (bp)      end (bp)

scaffold1_254817_bp     1       p3      (GCC)5  15      17114   17128   TGATGTCCTAGTGCGTCTCG    60.008  20      CATCCTGTCTTTGAACGGGT    59.966  20      226     17022   17247   TGATGTCCTAGTGCGTCTCG    60.008  20      ACATCCTGTCTTTGAACGGG    59.966  20      227     17022   17248   TGATGTCCTAGTGCGTCTCG    60.008  20      TGAGGGAGTTGTGGTGATGA    60.088  20      142     17022   17163

scaffold1_254817_bp     2       p1      (T)10   10      116694  116703  ATTGCAACCACCAAAGAAGG    59.971  20      CTCCAGGCGCTACGTTAATC    59.867  20      151     116600  116750  TCCCTACTGCATTGACCTCC    60.073  20      CTCCAGGCGCTACGTTAATC    59.867  20      223     116528  116750  ACACTGCCTTCGATTCATCC    60.081  20      CTCCAGGCGCTACGTTAATC    59.867  20      246     116505  116750

scaffold1_254817_bp     3       p3      (TTG)5  15      142162  142176  TCCACAACCCAATTTACGGT    60.088  20      CCAGAGTATGCCTGGTTCGT    60.134  20      212     142004  142215  GTCCACAACCCAATTTACGG    60.088  20      CCAGAGTATGCCTGGTTCGT    60.134  20      213     142003  142215  GCCAGTTTTGACAGGCGTAT    60.140  20      CCAGAGTATGCCTGGTTCGT    60.134  20      236     141980  142215

scaffold1_254817_bp     4       p3      (AGG)5  15      145861  145875  TTCGAGCTCGTCTGGTAGGT    60.012  20      ATTTATCGTCCAGTGCCCAG    59.955  20      212     145725  145936  GTTCGAGCTCGTCTGGTAGG    60.012  20      ATTTATCGTCCAGTGCCCAG    59.955  20      213     145724  145936  GGTTCGAGCTCGTCTGGTAG    60.012  20      ATTTATCGTCCAGTGCCCAG    59.955  20      214     145723  145936

scaffold1_254817_bp     5       p3      (CAT)6  18      182964  182981  TGTAGAGGGAGGCTGAGGAA    59.943  20      TTGCGAAAAGCAAGGAGAGT    60.132  20      270     182913  183182  TGTAGAGGGAGGCTGAGGAA    59.943  20      GCAAGGAGAGTCGGGTATGA    60.218  20      261     182913  183173  TGTAGAGGGAGGCTGAGGAA    59.943  20      AAAAGCAAGGAGAGTCGGGT    60.247  20      265     182913  183177

scaffold1_254817_bp     6       p3      (GAT)5  15      220964  220978  ATTGATACCGGTGGGTGAAA    60.051  20      TTGAAGGAACTTCGAATGGG    60.044  20      263     220929  221191  ATTGATACCGGTGGGTGAAA    60.051  20      TCGAATGGGATCAACTTTCC    59.871  20      252     220929  221180  ATTGATACCGGTGGGTGAAA    60.051  20      GGAACTTCGAATGGGATCAA    59.871  20      258     220929  221186

scaffold1_254817_bp     7       p2      (TA)7   14      249504  249517  TACCATGAGAAGGGGGAATG    59.744  20      TTTTCTCGACACGTCTGCAC    60.032  20      230     249469  249698  AGAAGGGGGAATGCAAAGTC    60.443  20      TTTTCTCGACACGTCTGCAC    60.032  20      223     249476  249698  GAGAAGGGGGAATGCAAAGT    60.443  20      TTTTCTCGACACGTCTGCAC    60.032  20      224     249475  249698

scaffold2_167145_bp     1       p3      (CTG)7  21      3622    3642    GGAGATATTTCCTCAGGGGC    59.866  20      AGGCAATGTCGATGCTATCC    60.066  20      240     3445    3684    AGAAGCAGAAGGAGGTGCAG    59.745  20      AGGCAATGTCGATGCTATCC    60.066  20      184     3501    3684    GGGAGATATTTCCTCAGGGG    59.722  20      AGGCAATGTCGATGCTATCC    60.066  20      241     3444    3684

scaffold2_167145_bp     2       p2      (AT)6   12      82759   82770   CCATCCCTCTTCCTCTTCCT    59.630  20      ACAAGGTGATGCACAATCCA    59.967  20      222     82648   82869   CCATCCCTCTTCCTCTTCCT    59.630  20      CACAAGGTGATGCACAATCC    59.967  20      223     82648   82870   CCATCCCTCTTCCTCTTCCT    59.630  20      CCACAAGGTGATGCACAATC    59.967  20      224     82648   82871

scaffold3_156598_bp     1       c       (GGA)5(GGT)5    30      70534   70563   GGTGGATGTATTGGATTGCC    60.021  20      GGCATGAACGACTTTTTGCT    60.257  20      183     70469   70651   GGGTGGATGTATTGGATTGC    60.021  20      GGCATGAACGACTTTTTGCT    60.257  20      184     70468   70651   TGGTCATCGAGCTGATGGTA    60.225  20      GGCATGAACGACTTTTTGCT    60.257  20      229     70423   70651

scaffold3_156598_bp     2       p3      (CGC)6  18      80301   80318   CCGAAAAGGCCATTAGTTCA    60.067  20      ACGACGAATGAAACCCTTTG    59.971  20      255     80206   80460   CCGAAAAGGCCATTAGTTCA    60.067  20      TTGGGGTGAGTTCCTTATCG    59.926  20      238     80206   80443   TCTTTTGACTTCGATGCCCT    59.813  20      ACGACGAATGAAACCCTTTG    59.971  20      216     80245   80460