对羟基苯甲酸脂类混合物的反相HPLC实验

一、实验目的

学习HPLC保留值定性方法和归一化法定量方法。
熟悉HPLC分析操作。

二、实验原理

在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，它们均为强极性化合物，因此可以采用反相HPLC进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相为固定相，甲醇水溶液为流动相。

由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在相同的实验条件下，将测得各未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行比较对照，即可确定未知物中各组分是否存在。这种利用纯物质对照进行定性分析的方法，适用于来源已知、组分简单的混合物定性分析。

本实验进一步采用归一化法定量，归一化法的使用条件以及计算公式均与气相色谱分析法相同:

对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此在紫外光度检测器上它们具有相同的定量校正因子，故上式可进一步简化为:

三、试剂与仪器

流动相瓶、紫外线检测仪、高压泵A、高压泵B、进样系统、微量注射器、10mL注射器、移液枪、滴管、100mL容量瓶、1000mL量筒、KH5200DB型数控超声波清洗器

对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯

四、实验步骤

1、储备标准溶液配置

打开分析天平的电源，放入称量纸，关闭右侧门，点击归零按键,天平读数为"O.0000"。用药匙取对羟基苯甲酸甲酯,放入分析天平中的称量纸上，用分析天平准确称量0.1000g。将称好的药品倒入烧杯中，在烧杯中加入约10ml甲醇，用玻璃棒搅拌至固体药品全部溶解，将溶解好的溶液用玻璃棒引流,转移至1#容量瓶中，用甲醇润洗烧杯(重复润洗三次)，将润洗烧杯的甲醇溶液用玻璃棒引流,转移至1#容量瓶中用甲醇溶剂定容摇匀。分别重复操作其他样品。

2、标准使用液配置

分别将少量1#2#3#4#容量瓶内甲酯标准储备溶液(约5ml)转移至1#2#3#4#烧杯。

移液枪下端套上枪头(将移液枪量程更改为100 uL)，用移液枪吸取对羟基苯甲酸甲酯的甲醇标准储备液100uL，将标准储备液移入10 mL容量瓶中，用玻璃杯引流,加入甲醇至刻度线下方，用滴管取甲醇溶剂定容，用手按住容量瓶塞翻转容量瓶3次,将5#中的溶液摇匀备用。重复操作三次配置6#7#8#溶液。

移液枪下端套上枪头,分别吸取吸取1#2#3#4#烧杯的对羟基苯甲酸甲酯的甲醇标准储备液100uL，将标准储备液移入9#容量瓶中。用玻璃杯引流,加入甲醇至刻度线下方，用滴管取甲醇溶剂定容，用手按住容量瓶塞翻转容量瓶3次,将9#中的溶液摇匀备用

将5#6#7#8#9#容量瓶放入超声仪中打开超声仪开关,脱气15分钟关闭超声仪开关。将超声好的标准使用液倒入烧杯中。取一干净的注射器至5#烧杯,将烧杯中标准使用液吸入到注射器中，更换0.45um针孔式过滤器，过滤标准使用液至10#烧杯。

3、待测样品准备

将待测溶液倒入到15#烧杯中，取注射器至15#烧杯,将烧杯中待测溶液吸入到注射器中,更换0.45u m针孔式过滤器，过滤待测使用液至16#烧杯。

4、更换流动相

用1L量筒量取500ml左右甲醇，用1L的量筒至超纯水制水机,用量筒取超纯水1L左右。将流动相瓶放置在试验台上，将盛有甲醇的量筒倒入较小的流动相瓶，盛有水的量筒倒入较大的流动相瓶，将相瓶至超声仪中，盖盖上流动相瓶,并留出缝隙打开电源,脱气15min，关闭电源。将流动相瓶放回至液相托盘。

5、测样

打开A高压泵电源,打开B高压泵电源,打开紫外线检测器电源，打开柱温箱电源开关，打开电脑电源双击桌面软件"伍丰液相",打开测试操作软件。打开A高压泵前盖放置在桌面上，将高压泵的排空阀逆时针旋转半圈，打开B高压泵前盖放置在桌面上，将高压泵的排空阀逆时针旋转半圈

打开测试软件操作界面，A泵流量设置输入栏中输入"100",设置A泵流量为100%，在流速设置输入栏中输入""5",设置流速为5 mL/min，点击"设置",确认参数设置，点击"泵启动",用流动相冲洗系统5min左右，点击"泵停止"，将A、B排空阀顺时针旋转半圈(复位)盖上前盖。

打开测试软件操作界面，在右侧紫外检测器设置中,波长设置输入栏中输入"254",设置波长为254 nm，点击"设置",确定波长设置，参数设置区域内, A泵流量设置输入栏中输入"60",设置A泵流量为60%。在流速设置输入栏中输入"1",设置流速为1 mL/min，点"设置"按钮,确定设置，点击"泵启动",开始测定仪器基线。

待仪器基线平稳后,即可开始进样，,将进样口扳手上扳至"LOAD"位置

31、用微量注射(5uL)器吸取16#烧杯溶液，将注射器插入进样口并推动活塞，将进样口扳手下扳至"INJECT"位置后,仪器开始自动运行测试样品，将样品打入进样口,将进样口扳手上扳至"LOAD"位置，拔出进样口的注射器，点击设置参数按钮设置参数,并确认保存路径，点击"确定",完成设置。

6、数据分析处理

双击桌面测试文件(生成的测试结果),打开测试结果图谱,进行数据处理。在图谱区域的空白处点击右键,选择"手工积分"选择"手工基线"，点击"文件",点击"数据导出"，点击"结果",点击"保存",将分析结果保存至桌面，后关闭数据分析界面

7、关机

打开实时采集软件，点击"泵停止",等待压力降至1Mpa，关闭A高压泵电源，关闭B高压泵电源，关闭检测器电源，关闭柱温箱电源开关，关闭电脑电源，实验结束。

五、数据记录及处理

定量分析

1：
RAB=2×0.7/0.4=3.5
RBC=2×0.4/0.4=2
2：
RAB=2×0.66/0.4=3.3
RBC=2×0.4/0.4=2
两次色谱峰面积和分离度没有明显差别，但色谱图二的样品A,B,C的保留时间均比色谱图一延后且延后时间大致相当。可能是图二中的色谱柱体积及死体积比图一更大。

六、思考题

1、HPLC色谱系统由哪些具体部件构成?每一部件有何作用?

HPLC仪一般由溶剂输送系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、检测系统和数据处理与记录系统组成。

1、溶剂输送系统

储液器：用来贮存数量足够、符合要求的流动相。配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。

脱气器：脱气的目的是为了防止流动相从色谱柱内流出时释放出气泡进入检测器，从而引起噪声，不能正常检测。

输液泵：将储液器中的流动相连续不断地以高压形式进入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。

梯度洗脱装置：是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种装置。

2、进样系统

进样器：是将样品送入色谱柱的装置，进样方式可以分为两种：阀进样或自动进样。比较常用的是采用自动进样器装样。

3、分离系统

色谱柱：对样品进行分离，是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响到分离的效果。

4、检测系统

检测器：将色谱柱连续流出的样品组分转变成易于测量的电信号，被数据系统接收，得到样品分离的色谱图。

5、数据处理和记录系统

对色谱数据进行处理，并参与HPLC仪器的自动控制。

2、本实验应对哪些色谱条件进行设置及优化，其中哪个条件对分离效果的影响最为显著?

硅胶纯度、颗粒形状及粒径、颗粒表面积、色谱柱温度及长度；

色谱柱温度对分离效果影响最为显著。

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