Gut代谢组学文献分享:小小肠道菌群决定肾的“生死”

终末期肾病（ESRD）是慢性肾脏病（CKD）的一种晚期并发症，是全世界引起高死率亡的主要原因之一。目前，治疗ESRD的费用惊人，仅在美国每年大约需要花费340亿美元。

代谢组学文献分享，阿趣生物协助客户中国农业大学任发政院士和于政权教授与团队在国际权威期刊《Gut》(IF:17.943)上发表过关于ESRD的最新研究成果，整合肠道菌群、血清和粪便代谢组多组学数据，建立223名血液透析患者和69名健康对照者的大规模队列，以及24名个体的独立验证队列，表明产毒的肠道菌群通过产生有害代谢物加重ESRD临床预后，揭示在未来的临床对照实验（CCT）中可通过调节肠道菌群的方法降低患者的尿毒症毒性，提高生存质量或减少对透析治疗和肾移植资源的需求。

题目：Aberrant gut microbiota alters host metabolome and impacts renal failure in humans and rodents

样本类型：临床血清、粪便

期刊：Gut

影响因子：17.943

发表时间：2020年4月2日

技术路线

采集235例ESRD患者和81例健康对照者临床指标信息，并进行血清代谢组、粪便代谢组、粪便宏基因组的实验。代谢组学文献分享，技术路线如下图所示：

（A）组学类型；

（B）基于ESRD患者组和健康组数据的差异物筛选；

（C）多组学数据相关性分析；

（D）与代谢物相关的宏基因组预测模型建立和聚类的CAG（Co-abundance genes）分析；

（E）动物实验验证ESRD患者肠道菌群和益生菌治疗作用。

研究结果

1.ESRD患者与健康人的血清代谢谱不同

采用非靶代谢组技术检测血清样品，鉴定到180个血清代谢物，筛选到134个差异物（图1A）。代谢组学文献分享，ESRD组和对照组血清代谢谱明显不同；鉴于患者群体相对于原发性疾病类型的异质性，作者将其分为三种主要类型：肾小球肾炎（n=76）、糖尿病肾病（n=73）和其他（n=74），并分别与对照组进行比较。发现血清代谢物中占比≥97%的物质在整个人群中显示为不同，只有少量代谢物（<9%）在不同组中具有显著不同的丰度。这表明ESRD血清代谢组在很大程度上与原发病无关。

ESRD血清代谢组的主要特征是9种尿毒症毒素的富集和胆汁酸组成的不平衡（如结合胆汁酸与非结合胆汁酸、初级胆汁酸与次级胆汁酸（SBAs））（图1C）。通过对随机选择的60名患者（ESRD患者，n=40；健康对照组，n=20）目标代谢物检测，证实了ESRD患者中尿毒症毒素的累积。据报道，这类毒素是由肠道菌群通过降解芳香族氨基酸（AAAs）和多酚产生的，氧化三甲胺（TMAO）例外，它是由细菌降解胆碱和肉碱产生的。

图1 与ESRD患者明显相关的血清和粪便代谢谱特征

2.ESRD患者的粪便代谢组的变化与血清代谢组相关

ESRD组和对照组的粪便代谢组实验共鉴定255个物质，其中有98个差异代谢物（图1D）。尿毒症毒素前体和SBA在ESRD组表达量上调，初级胆汁酸，短酸（SCFAs）及其衍生物表达量下调。代谢组学文献分享，这些代谢物占粪便代谢组差异物的49.6%。Procrustes分析表明血清和粪便代谢谱具有很强的协同性（图1F）。

最重要的是，血清尿毒症毒素与其粪便前体密切相关，这表明ESRD患者肠道代谢物的变化对血清中尿毒症毒素的积累有显著贡献。为了进一步验证代谢组学结果，作者增加了一个独立队列，包括12名ESRD患者和12名健康对照。ESRD患者血清尿毒症毒素的积累在新队列中得到证实（补充图7A）；同样，在患者粪便中，观察到毒素前体升高，并伴有明显的SCFAs和SCFA衍生物减少的趋势（补充图7B）。

补充图7 独立队列中血清和粪便代谢物的验证

3.ESRD患者肠道菌群的分类和功能特征

为了研究肠道菌群是否介导了ESRD患者的代谢组变化，作者通应用宏基因组（Illumina HiSeq平台）测序技术进行肠道菌群的研究，每个粪便样本平均产生7470万次读取（11.2 Gb数据）。代谢组学文献分享，鉴定900个宏基因组物种（MGS），其中约66%可以被鉴定到属水平。利用基因图谱，作者首先发现ESRD肠道菌群的微生物多样性、分类组成和功能与健康人有显著差异。

由于队列中超过一半的物种发生了显著变化（457/900 MGSs，51%），因而得出结论：ESRD可强烈影响肠道菌群。患者体内丰度上调的物种有Eggerthella lenta、Flavonifractor spp、Alistipes spp、Ruminococcus spp 和 Fusobacte rium spp（图2B）。丰度下调的物种包括Prevotella spp , Clostridium spp 和几种产丁酸盐菌 (Roseburia spp, Faecalibacterium prausnitzii 和 Eubacterium rectale）。ESRD患者粪便中SCFAs的减少可能是由于产SCFA菌群的减少。与芳香族氨基酸（AAA）降解和SBA生物合成功能相关的菌群和基因在ESRD患者中高表达，与粪便代谢组的尿毒症毒素前体和SBA结果一致。此外，这些功能与血清和粪便中相应ESRD相关代谢物的浓度显著相关（图2C）。可以得出的结论是，ESRD患者尿毒症毒素的累积与肠道微生物群介导的AAA降解和微生物SBA生物合成有关。

图2 ESRD患者血清和粪便中菌群特征及其与代谢物的变化关系

4.ESRD患者肠道菌群的改变介导代谢组的变化

为了进一步探讨肠道菌群与代谢物之间的关系，作者对宏基因组、血清和粪便代谢组进行多组学关联分析。在ESRD患者和健康对照组中都发现了紧密的联系（图3A，B）。代谢组学文献分享，ESRD患者与健康对照组相关性网络明显不同，只有约12%的相关性是常见的。值得注意的是，尿毒症毒素和胆汁酸占ESRD患者血清代谢物相关性的95.0%，明显高于健康对照组（69.3%）。同样，ESRD患者的血清尿毒症毒素和胆汁酸也受到肠道菌群和粪便代谢组的显著影响（图3C）。

肠道菌群对ESRD患者代谢谱的影响相当大，分别占血清和粪便代谢组变异的31.3%和39.0%（图3D）。这些结果表明，肠道菌群除了影响肾功能外，似乎是对宿主的粪便和血清代谢组的也具有一定的影响作用。

图3 肠道菌群对ESRD患者血清和粪便代谢组的影响

5.ESRD患者的肠道菌群对毒素积累作用

为了进一步证实肠道菌群在尿毒症毒素和SBA产生中的作用，作者重点关注预测编码这些化合物的合成途径中关键酶基因。鉴定了5134个编码6种尿毒症毒素和SBA关键合成酶的基因。代谢组学文献分享，这些基因在ESRD患者中明显更丰富。在此发现的指导下，作者应用随机森林模型来确定每个毒素或SBA与包含毒素/SBA合成酶编码基因的物种丰富度之间的相关性。

血清或粪便中毒素强度和SBAs浓度预测最大化的随机森林模型确定了大约83种菌群（图4）。与ESRD患者中尿毒症毒素和收缩压的增加一致，大多数（59%）菌群在患者中比在对照组中更丰富（图4）。重要的是，与尿毒症毒素或SBA产生相关的菌群与ESRD临床指标直接且显著相关。因此，作者假设至少部分肠道菌群通过尿毒症毒素和SBAs加重ESRD。基于上述发现，产尿毒症毒素和SBA的肠道菌群可作为ESRD的诊断标志物。

图4 ESRD患者的肠道菌群有助于尿毒症毒素

的产生及胆汁酸的生物合成

6.CDK（慢性肾脏病）小鼠动物模型的肠道菌群影响毒素积累和肾病发展

为了验证以上假设，即肠道菌群至少部分通过尿毒症导致肾衰竭，作者将来自ESRD患者或健康供体的新鲜肠道菌群移植到腺嘌呤诱导的CKD模型无菌小鼠体内。代谢组学文献分享，发现接受ESRD肠道菌群移植的小鼠表现出更严重的肾纤维化、肾小球硬化和氧化应激，以及血清尿素和肌酐水平的升高趋势。尿毒症毒素（包括对甲酚硫酸盐、苯乙酰甘氨酸、硫酸苯酯和硫酸吲哚酚）的血清水平显著升高（图5D）。这些结果表明ESRD患者肠道菌群的尿毒症毒素的调节对肾脏疾病的发展起到了一定的作用。

紧接着，作者验证了一个假设，即在肠道菌群中存在产尿毒素症毒素前体的菌群，会加重肾病的发展。为此，作者移植ESRD患者菌群中高丰度的 E. lenta（预测参与马尿酸和苯乙酰谷氨酰胺生成）和 Fusobacterium nucleatum（预测参与吲哚和苯酚的生成），发现可使CDK模型小鼠或大鼠的血清尿毒症毒素升高，并加剧肾纤维化和氧化应激，这些结果表明菌群产生的尿毒症毒素可加重肾脏疾病。那么可得到一个推论，减少相应菌群丰度会减轻疾病的严重程度。故而，作者给CKD大鼠灌胃动物双歧杆菌A6（一种促进健康的益生菌），发现这两种产毒素菌群E. lenta和 Fusobacterium nucleatum的丰度显著降低。同时，血清尿毒症毒素、肌酐和尿素浓度也显著降低，肾纤维化和肾小球硬化程度降低。因而可通过动物双歧杆菌调节产毒肠道菌群的作用治疗CKD大鼠，减轻肾脏疾病的发展。

图5 动物实验证实ESRD患者肠道菌群促肾病发展

研究结论

在这项研究中，作者证明肾衰竭患者的肠道菌群具有加速一些有毒化合物生物合成的功能，导致尿毒症毒素的浓度升高和加重肾脏疾病。ESRD患者产毒菌群对血清中尿毒症毒素的积累有着重要的贡献。这项工作有助于在人类受试者中建立肠道菌群与肾脏疾病发展之间的因果关系。代谢组学文献分享，ESRD患者肠屏障容易受损，促进尿毒症毒素前体进入循环系统。这将有助于血清毒素的积累。近期的研究结果表明，ESRD患者的肠道菌群可通过产生过量的苯酚来破坏肠屏障。

在肠屏障受损或破坏的情况下，更多的尿毒症毒素可渗透到ESRD患者的循环中，加重肾脏疾病及其并发症的发展。ESRD患者体内毒素积累的一个原因是传统透析法不能有效地去除微生物衍生的尿毒症毒素。因此，在未来临床对照试验中，对不同程度肾功能受损的患者，需要探索通过饮食、益生菌或其他治疗手段调节肠道菌群能否减少解尿毒症毒素的积累，提高患者的生存和生活质量，减少对透析治疗或肾移植资源的需求。

文章延伸

阿趣生物为本研究提供了VOCs非靶标代谢组学检测分析以及靶标代谢组学检测分析服务。

代谢组学文献分享，挥发性有机化合物（VOCs, Volatile organic compounds）通常是指常压下，沸点在50℃-260℃的各种有机化合物。VOCs按其化学结构，可以进一步分为烷类、芳烃类、酯类、醛类和其他等。常见的有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、苯乙醇、三氯甲烷、丁酸丙酯、2-壬酮、2-辛酮等。研究表明，VOCs与人体神经系统发育、肝脏毒性、血液系统等方面有重大关系。

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