短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究
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合作单位：Zhejiang Ocean University
参考文献：Yuping Tang, Yafeng Zhou, Qiaojun Zhao, et al.. Process Biochemistry, 2020. DOI: 10.1016/j.procbio.2020.02.015 （IF = 3.06）
本文首次报道采用生物酶法通过MOT来制备奥利司他中间体（R）-MHOT，该研究成果为奥利司他的绿色合成奠定了基础。
背景：
奥利司他（Orlistat）是一种有效的，特异性的，长效胃肠道脂肪酶抑制剂，可以通过抑制脂肪酶来减少饮食中脂肪的吸收，进而减轻体重。目前，奥利司他的获得途径主要分两种：以天然产物利普斯他汀（Lipstatin）为起始物进行结构修饰得到；或者采用天然产物全合成方法。然而，利普斯他汀难以提取，导致患者难以负担昂贵的医药费用。而全合成方法可以减少花费，是目前制备奥利司他的主要方法。
（R）-MHOT是合成奥利司他过程中非常关键的中间体，目前获得（R）-MHOT的方法主要有化学合成和生物合成两种。化学方法由于ee值低，花费高等缺点难以大规模生产，因此生物合成方法是目前最具前景的合成方法。
近年来，还原酶在手性化合物的合成中发挥着重要的作用，大量的手性化合物都可以采用还原酶来合成。然而目前还没有还原酶不对称还原MOT产生（R）-MHOT的相关报道。本文根据之前研究的成果，采用NaSDR-G145A/I199L酶催化还原MOT产生（R）-MHOT，产量达到50 g/L。并采用分子模拟方法对该酶与MOT的结合模式及突变体产率增加的机制进行了深入研究。
方案设计：
作者先构建得到NaSDR及G145A/I199L突变体重组蛋白，并在不同温度，pH等条件下测试酶对MOT的催化效率。最后采用分子模拟方法，研究了酶及突变体与MOT的最适催化构象，并解释了突变体产率增加的原因。
主要结果：
在非线性回归的分析基础上，NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的Km值分别为0.08和0.11 mM，而野生型和突变体的kcat值分别为0.90/s和2.91/s，突变之后该酶的催化效率提高了3倍以上。
表1 NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化的动力学参数
通过测试不同pH和不同实验温度对酶活性的影响，发现在pH=7和35℃附近，该酶具有较好的催化能力，如下图所示。
图1 pH（a）和温度（b）对NaSDR-G145A/I199L活性的影响
最后，本文采用分子对接方法研究了NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的最佳构象进行了研究。首先采用同源模建方法得到蛋白的三维结构并进行合理性评估。再将MOT分别对接到NaSDR和NaSDR-G145A/I199L的催化活性位点，结果如图2所示。从图中可以看出，MOT主要可以结合在蛋白的疏水空腔中，与辅酶NADH具有较近的距离，适合催化反应的发生。
图2 蛋白结构评估的拉氏图（a）和ERRAT值分布（b），MOT在NaSDR（c）和NaSDR-G145A/I199L（d）活性位点的结合模式
为了进一步研究突变前后MOT与蛋白的结合差异以及引起催化效率变化的主要原因，图3分析了MOT与周围氨基酸残基的相互作用情况。从图中可以看出，MOT主要结合在由Ile89, Val144, Met195, Leu196, Val214, Phe260 和NADH组成的疏水性口袋中。Ser143和Tyr156可以作为氢键供体与MOT形成氢键相互作用。而突变体中，Gly145突变为Ala145，Ile199突变为Leu199，可以进一步增强活性位点的疏水性质，进而增强MOT与突变体的结合能（由-5.02增加到-5.61 kcal/mol）。并且在突变之后，MOT中的羰基碳原子与NADH的催化距离由3.00 Å减小到2.73 Å，进一步证明了突变之后更有利于MOT的催化反应。
图3 MOT与NaSDR（a）和NaSDR-G145A/I199L（b）活性位点氨基酸残基的相互作用，MOT在突变前后关键的催化距离变化（c）
总的来讲，本文通过实验证明了NaSDR-G145A/I199L在35℃、中性条件下催化MOT产生（R）-MHOT的产量达到了50 g/L，并通过分子模拟方法从原子层面解释了突变体产量提升的可能原因。定点突变或定向进化技术可以进一步提高该酶的催化能力，并用于大规模制备中间体（R）-MHOT。
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