铁死亡细胞实验相关抑制剂、激动剂
小白：害，买了抑制剂和激动剂，储备液倒是配好了，可是不知道咋加药。总不能一起怼进去细胞培养基吧？
师兄：铁汁儿！事事有依据，要看文献的。
上面的问题，相信很多初次接触小分子抑制剂 (激动剂) 的小伙伴肯定会遇到。萌 Cece 我，作为一个小可爱，分享科研路上加药三步法：明确实验目的，文献查阅浓度，初步尝试后的调整。
下面， 我们来看看小白的“给药闯关记”
小白有肾癌细胞系 786-O，实验目的是验证新买的药物 Erastin 可以诱导 786-O 发生铁死亡。于是小白文献搜索，他打开了谷歌，输入了关键字 cell 786-O Erastin，搜出了以下文献。
小白若有所思地打开了其中一篇 Nrf2 represses ER stress-related ferroptosis in renal carcinoma cells via HO-1，在这篇文献中，文献作者使用不同浓度 (1-40 μM) 处理细胞 24 小时，MTT 法检测细胞活力，结果表明 10 μM 时就表现出显著性差异。而且该文中，作者还选用了 10 μM 这个浓度进行了细胞超微结构观察进一步确定铁死亡。
当然，勤快的小白还看了其他文献。最后，小白用 1-40 μM 的浓度梯度，24 和 48 小时 2 个时间梯度进行实验，并拿到了想要的实验结果。
A: MTT 检测细胞活力; B: 细胞超微结构观察
关卡二：一石二鸟
上面提到小白证明了 Erastin 诱导 786-O 细胞的铁死亡。现在小白手里有个实验室自己合成的药物 X，未知是否具有保护细胞免受铁死亡的作用。
小白又一次上了谷歌，输入关键字：Erastin, ferroptosis, cell, protect, inhibitor。小白通过文献查阅发现，不同的文献中，要证明某种药物对铁死亡的保护作用，大多数情况下会将该药物在诱导剂之前预处理，文献中往往会出现 (pretreatment, pretreated 等字眼)，当然也不完全排除同时给药的可能性 (with or without 等字眼)。不同文献中的验证方法也是“多姿多彩”。
首先，最简单的是检测细胞活力测定，如图 3A，MTT 结果显示，提前用不同抑制剂处理过的 786-O 细胞活力明显上调。图 3B 中，在原代胰岛细胞中，使用乳酸脱氢酶测定法 (LDH release 为检测指标) 进行细胞活力测定，结果表明 Ferrostatin-1，DFO 的提前预处理可明显下调 Erastin 诱导的 LDH 释放。
其次较为常见的就是 ROS 测定与胞内脂质过氧化测定。如图 3C，SH-SY5Y 细胞中，Erastin 处理会导致细胞中 ROS 活性氧水平增加 (DCFH-DA 活性氧探针检测)，但是铁死亡抑制剂 DFO 会显著减少 Erastin 诱导的活性氧增加。
图 3D，Hela 细胞中，用 C11-BODIPY 染料进行脂质活性氧测定，结果表明药物预处理显著增加脂质活性氧的积累。
A: 不同抑制剂提前预处理 786-O 细胞; B: 乳酸脱氢酶法测定细胞活力; C: ROS 探针检测活性氧; D: 胞内脂质活性氧的检测
看完以上文献，小白有了一些想法，他设置了以下分组 (Table 1. 小白的实验分组)，并且在 MCE 购买了文献中常用的铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 作为阳性对照。根据文献设置了不同时间梯度，又一次得到了想要的实验结果。
拿到了上述结果后，新的问题又来了。小白需要沉默掉其他通路一个基因，验证他的小分子化合物可能与该通路有关。那么现在至少有基因沉默，诱导剂，药物 X 三个变量了！
小白又认真看了很多用到 siRNA，小分子化合物的文献。如在 MDM2 and MDMX promote ferroptosis by PPARα-mediated lipid remodeling 这篇文献中，作者目的是证明 MDMX 存在时，可独立于 p53 促进细胞对铁死亡的敏感度 (图 4A)。Western Blotting 结果证明 siRNA 成功敲低 SK-Hep1 和 SK-Hep1 p53 KO 细胞中 Mdmx 的表达 (图 4B)。使用 siRNA 敲低 MDMX 时，相对 siCtrl 组，在 SK-Hep1 以及 p53 KO 细胞中 Erastin 诱导的铁死亡程度均被显著降低 (图 4C)。并且，siMDMX 的抑制作用不是短暂的，并且在给药后至少 48 h 内会持续一定程度 (图 4D)。综上所述，Erastin 诱导的铁死亡需要 MDMX，而 MDMX 发挥作用独立于 p53。
A: MDMX 抑制剂作用机制简图; B: siRNA 沉默 Mdmx 表达; C: Erastin 诱导的 p53 KO 细胞铁死亡; D: 细胞活力测定
基于查到的文献，小白将他的实验优化成了 2 步：先确保 siRNA 转染成功，再加小分子化合物进行实验。
热火朝天的小白，再一次拿到的实验结果。组会上，老师听着小白的工作汇报，点头露出欣慰的目光。真是一段充实的时光，小白从内心发觉：实验目的明确，多多查阅文献，实验过程中有的放矢的循序渐进，效果简直绝绝子。
总结：
看着小白的实验历程，小 M 建议，无论做什么实验，一定要明确心中所求，基于已经发表的文献中“取经”，设计自己的实验。其次，保持乐观的心态，胜败乃兵家常事，循序渐进，不断改进，相信 SCI 在向你疯狂招手。
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参考文献
1. Yuanqing Shen, et al. Nrf2 represses ER stress-related ferroptosis in renal carcinoma cells via HO-1. Biorxiv
2. A M James Shapiro, Antonio Bruni et al. Ferroptosis-inducing agents compromise in vitro human islet viability and function. Cell Death Dis. 2018 May 22;9(6):595.
3. Xue Yao, Yan Zhang, Bao-You Fan, Yi-Lin Pang, et al. Neuroprotective effect of deferoxamine on erastininduced ferroptosis in primary cortical neurons. Neural Regen Res. 2020 Aug;15(8):1539-1545.
4. D Tang, X Sun, et al. HSPB1 as a novel regulator of ferroptotic cancer cell death. Oncogene. 2015 Nov 5;34(45):5617-25.
5. Divya Venkatesh, Nicholas A O'Brien, Fereshteh Zandkarimi, 1, Michael E Stokes, et al. MDM2 and MDMX promote ferroptosis by PPARα-mediated lipid remodeling. Genes Dev. 2020 Apr 1;34(7-8):526-543
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