Super Enhancer(超级增强子)分析——ROSE包（v1.3.1）的安装及使用详解

1、ROSE安装

2、环境变量配置

3、准备所需文件

4、ROSE软件分析超级增强子

5、输出结果文件

6、入过的坑

最近需要分析超级增强子（Super enhancer），仔细研究了Richard A.Young实验室开发的ROSE包（全称：RANK ORDERING OF SUPER ENHANCERS, 原文：DOI: 10.1016/j.cell.2013.03.035, DOI: 10.1016/j.cell.2013.03.036.）。作为一个小众的专业包，在ROSE安装和使用操作过程中碰到了太多的问题，花费了一周的时间总算通关。所以决定写个详细教程，记录一下目前最新版ROSE v1.3.1的安装和使用。

1、ROSE安装

ROSE是基于python编写的包，目前的最新版适用python3，根据github上的说明，ROSE依赖：

samtools
R version > 3.4
bedtools > 2
python3

（本人的软件版本为samtools 1.15，R 4.2.1，bedtools 2.30.0，Python3.10.4，均安装在ubuntu系统环境下，非conda环境）

ROSE代码包的链接为：https://github.com/stjude/ROSE

这两个压缩包随便下载哪个格式都可以，用linux桌面系统的可以直接用浏览器下载后提取，也可以打开终端用wget下载，下载之后解压缩就可以了，不需要安装。

wget https://github.com/stjude/ROSE/archive/refs/tags/1.3.1.zip
unzip 1.3.1.zip
cd 1.3.1#或者
wget https://github.com/stjude/ROSE/archive/refs/tags/1.3.1.tar.gz
tar -zxvf 1.3.1.tar.gz
cd 1.3.1

(因为1.3.1这个文件夹名字太迷惑了，本人将1.3.1文件夹的名字为ROSE-1.3.1再进入文件夹查看）

文件夹里应该是这样的：

2、环境变量配置

这一步很重要，否则无法调用所需的脚本。

vim ~/.bashrc
#用vim编辑器打开bashrc，按A，在最后一行写入以下内容PATHTO=/path/to/1.3.1    #/path/to/是ROSE文件夹1.3.1所在的路径，如果修改过文件夹名称用新的名称，例如PATHTO=$HOME/software/ROSE-1.3.1
PYTHONPATH=$PATHTO/lib
export PYTHONPATH
export PATH=$PATH:$PATHTO/bin#写完后按esc退出编辑模式，输入：wq!保存并退出vim编辑器
#做一下source
source ~/.bashrc

3、准备所需文件

（1）annotation文件夹里已经存放了常用的人和小鼠UCSC版本refseq文件：

如果不是人或者小鼠的样品，可以从https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables下载UCSC table track format file，命名为[GENOME]_refseq.ucsc（例如hg19_refseq.ucsc），放到annotation文件夹下面。

（2）准备bam文件和gff文件

bam文件是做完mapping之后生成的文件，需要H3K4me1或者H3K27ac样品的bam文件以及对应的Input样品bam文件，做过sort排序。ROSE分析要求bam文件的染色体名称以“chr”开头，可以参考https://www.jianshu.com/p/94b9602a1036修改BAM文件的染色体名称，修改完染色体名称的bam文件重新用samtools软件生成.bai索引文件。

gff文件使用call peak生成的narrowPeak文件，用excle或者wps打开（方便查看列数），按要求调整每一列的内容：

第1列：染色体位置（chr#）

第2列：每个增强子区域的特定id

第4列：区域起始位置

第5列：区域终止位置

第7列：正负链信息（+, -, .）

第9列：每个增强子区域的特定id

上述没有要求的列，内容可以为空或者原来的内容，但是一定要有这一列，如果第2列和第9列的内容不同，ROSE将使用第2列的值。ROSE额外提供的测试数据包里的gff文件范例如下：

修改完后保存文件，并且修改文件的后缀名为gff文件。

（3）将准备好的bam文件和gff文件（总共应该有5个文件，即1个gff文件，2个bam文件，2个bam文件对应的bai索引文件）放在一个文件夹里（例如命名为data），然后将该文件夹放在ROSE文件夹里。分析完成后将生成的结果文件夹转移出来保存在合适的位置，data文件夹删除，注意不要误删ROSE文件夹里原有的文件和文件夹。

4、ROSE软件分析超级增强子

在正式分析数据前，最好先下载测试数据进行分析测试，能正确跑通并且获得完整的分析结果后再分析自己的数据，这样可以确认命令行和依赖环境都没有问题。如果可以跑通测试数据，但是在分析自己的数据时报错中断，一定是自己的数据文件没有准备好，请按要求检查准备的文件。测试数据下载：

链接：https://pan.baidu.com/s/1p52x3tVIQg3j3ju_elLWTQ
提取码：oejw

测试数据包ROSE_TEST解压缩后能看到以下几个文件夹和文件：

其中data文件夹为所需的测试文件，将整个data文件夹复制到ROSE文件夹下。example文件夹、example.sh为老版ROSE输出的结果文件夹和运行命令，log为老版ROSE运行的日志文件（大佬原有的文件，供起来）。example-v1.3.1文件夹、example-v131是在ROSE v1.3.1版本运行输出的结果文件夹和运行命令，log_ROSE_v131_test是日志文件（本人跑通的，日志行不一样或者缺少结果文件就是没跑通或没跑完），供参考。

运行命令时在ROSE文件夹下打开终端，此处详细解释一下：

python ./bin/ROSE_main.py -g HG18 \
-i ./data/HG18_MM1S_MED1.gff \
-r ./data/MM1S_MED1.hg18.bwt.sorted.bam \
-c ./data/MM1S_WCE.hg18.bwt.sorted.bam \
-o example \
-s 12500 \
-t 2500

（1）如果linux系统没有指定默认python版本，开头需要使用python3，如果指定了Python3为默认版本，只要python即可。

（2）ROSE运行需要调用的几个脚本，都在ROSE文件夹下的bin文件夹里，而数据文件在data文件夹里，所以需要指定位置 ./bin 或 ./data。

（3）-r 样品bam文件名，-c control/Input bam文件名，-o 输出结果文件夹名。

（4）可选参数：

-s STITCHING_DISTANCE，合并两个region的最大距离，默认值为12.5kb。
-t TSS_EXCLUSION_ZONE_SIZE，排除TSS区域大小，排除与TSS前后某距离内的区域，以排除启动子偏差（默认值：0；推荐值：2500）。如果设置该值为0，将不会查找基因。

5、输出结果文件

ROSE输出的结果都在一个文件夹里，文件夹名称是参数 -o 自己设置的文件夹名。v1.3.1版输出的结果文件包括2个文件夹和9个文件夹外文件。以测试结果为例，如下图：

gff文件夹里包含2个文件，mappedGFF文件夹里包含4个文件，文件夹外有9个文件，文件具体内容参考Young Lab :: ROSE - Ranking Of Super Enhancer, Download (mit.edu)。与老版ROSE相比，v1.3.1版多了4个文件夹外文件，有些文件名也与以前版本不一样。

6、入过的坑

（1）关于gff文件：虽然一些教程说可以直接使用call peak生成的.bed文件替代.gff文件，ROSE也可以自己转换出gff文件，但是前期使用narrowPeak.bed文件一直没有跑通，出现报错。也许是我们采用MACS分析获得的narrowPea.bed在某些格式上是ROSE不能识别的，所以最后还是老老实实的自己做了gff文件。

（2）关于分析时长：应该跟硬件配置以及测序文件大小有关。进程中会有各种分析状态提示，结果文件夹里的文件也会慢慢的出现，直到完全获得2个文件夹和9个文件夹外文件。然而此时并没有结束，运行状态会长时间停滞在如下状态，需要耐心等待，等到自动返回到初始输入命令行的状态才是真正的结束：

21000
22000
23000
24000
25000
26000
27000
28000
29000
30000
31000
32000
33000
34000
35000
36000
37000
38000
39000
MAKING TSS COLLECTION

PS：不要怀疑，会结束的，并且没有任何报错。

希望每一位科研打工人都能顺利获得好结果！

参考链接：

super-enhancer神器ROSE的使用 - 简书 (jianshu.com)

“Super-enhancer神器“ROSE安装及教程_JiangQ_1996的博客-CSDN博客

Young Lab :: ROSE - Ranking Of Super Enhancer, Download (mit.edu)

使用ROSE鉴定超级增强子 - 腾讯云开发者社区-腾讯云 (tencent.com)

GitHub - stjude/ROSE: ROSE: RANK ORDERING OF SUPER-ENHANCERS

ROSE: Rank Ordering of Super-Enhancers (nih.gov)