一、基本概念

1．动物细胞培养技术(animal cell culture) ：指从用无菌方法将动物体内的细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

体外培养（in vitro culture)：分为组织培养（tissue culture）；细胞培养（cell culture）；器官培养（organ culture）。

二、动物细胞体外培养特点（P243)

无细胞壁，对环境极其敏感，包括PH值、温度、剪切力；
动物细胞生长缓慢，培养时间长。
更易受微生物污染，需要防止污染问题。
对营养要求高，一般还需要血清。
绝大多数动物细胞具有贴壁依赖性生长特征；
长期培养易变异；

总之，动物细胞培养的要求更高，难度更大。

三、动物细胞培养的环境要求

1.恒定的温度

偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。温度除影响细胞的生长代谢外，在大规模培养中影响重组蛋白药物的表达。

2. 气体

需要O2、CO2，氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分；

CO2与培养基pH密切相关。
气体环境常有95%空气和5% CO2构成。

3.pH

大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,每种细胞都有其最适pH值.
当pH低于6.8或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。

4.营养：要求高，需要葡萄糖、氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子、血清。

5.渗透压：260-320mmol/L。

6.无毒、无污染

四、体外培养细胞生物学特性

（一）体外培养细胞的生物学特点

1.基本生物学特征和体内相似

2.体内外细胞的差异性

体外培养细胞有时遗传学特征改变，如形态功能改变，变成肿瘤细胞，细胞分化状态改变。

（二）培养细胞的生长方式及形态（教材p227）

1.贴附生长一贴附型细胞：贴附于支持物表面才能生长的细胞。

一◆ 贴附含义:细胞之间相互接触;细胞与细胞外基质结合。

2.悬浮生长一悬浮型细胞：于悬浮状态下即可生长。

3.兼性贴壁生长——兼性贴壁细胞：兼具上述两种生长方式

贴壁细胞按照培养细胞的形态不同，主要分为：成纤维细胞（常见）、上皮细胞（常见）、游走细胞（不常见）、多形细胞（不常见）。

（1）成纤维细胞型（fibroblast）

形态：呈梭形或不规则三角形生长，卵圆形细胞核位于中央，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起。

生长特点：细胞一般并不紧靠相连；生长时呈放射状、漩涡状、火焰状走向。

来源：由中胚层间充质组织起源的组织。如心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞等。

（2）上皮细胞型(epithelium)

形态：呈扁平不规则多角形，中央有扁圆形核。

生长特点:细胞彼此紧密相连成单层细胞，呈现“铺路石状”。相靠—紧密相连—成薄层—铺路石状

来源:内胚层和外胚层。如皮肤表皮细胞、消化管和呼吸道上皮细胞、血管内皮细胞等。

（3）游走细胞型

在支持物上散在生长，一般不连成片。
细胞胞质经常伸出伪足或突起。
生长位置不固定，呈活跃的游走或变形运动，速度快且方向不规则。
此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。
来自于单核巨噬细胞系统的细胞。

（4）多形细胞型

形态上不规则的细胞，一般分胞体和胞突两部分。

如神经元、神经胶质细胞。

2 悬浮型细胞：

悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。

见于少数特殊的动物细胞，如血液白细胞、淋巴细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞。

形态特点：胞体始终为球形，单个或小细胞团。

3.兼性贴壁细胞

贴附时：呈上皮或成纤维细胞的形态；
悬浮时：呈圆形；

(三）培养细胞的生长特点（教材p229)

贴附和伸展；
接触抑制；
密度抑制；

2. 培养细胞的生命期（life span of culture cells)

概念：指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。

大致可以分为三个阶段：原代培养期——传代期（动物是传代，植物是继代）——衰退期

(1)原代培养(Primary Culture)期

初代培养期，把细胞从机体内取出细胞或组织接种培养到第一次传代的阶段，一般持续1~4周。

特点：

细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛；
原代细胞培养通常有明显的异质性；
细胞独立生存性差，细胞克隆形成率很低；
多呈二倍体核型，生物学形状尚未发生很大变化；
更能代表其来源的细胞类型及组织特异性，适宜进行药物检测、移植等研究。

(2)传代期（passage culture )

传代培养，当细胞持续生长增殖到一定阶段，达到一定细胞密度之后，将细胞分离成两部分（或更多）转接到新的培养器皿中继续进行培养的过程。

特点：

细胞增殖旺盛，在细胞整个生命期中此期的维持时间最长，一般情况下，可传代10~50代；
反复传代可以导致细胞失掉二倍体性质或发生转化；
能够维持二倍体核型，被称为二倍体细胞系；
细胞应当在初代或传代早期冻存为好。

细胞系（cell line）：

由原代细胞培养之后经过初步纯化(传代)，获得一种以一种细胞为主，能够在体外长期生存的相对均一的细胞群体。

细胞株（cell strain）：

细胞系经过克隆或其他筛选方法（进一步筛选过程）得到由单细胞增殖形成的细胞群。

有限细胞系和无限（永久）细胞系：

按照是否可以连续传代，可以将细胞系分为有限细胞系（finite cell line）和无限细胞器（infinite cell line）。

有限细胞系：细胞自动物体内取出后，在培养中仅持续生长有限时间，然后将自行停止生长。这种寿命仅能维持一段时间的细胞系，称为有限细胞系。
无限细胞系：细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系（continuous cell line）。

 无限（永久）细胞系有如下特征：

细胞形态变化，如细胞变小，粘附性减小，具有较高的核质比；
生长速度增加，倍增时间缩短；
对血清依赖性减小，贴壁依赖性降低；
细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内，生癌率增加。

(3)衰退期(decline phase)

一般情况下，细胞传代10~50次左右增殖逐渐缓慢，以至于完全停止，进入衰退期。

此期细胞依旧存活，增殖很慢或基本停止，细胞形态轮廓增强，进而发生细胞衰退、死亡，结束整个体外培养的生命期。

注意：细胞在三期中的任何一期（一般发生在传代后期或衰退期），在某些因素影响下，可能发生自发转化，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。

细胞转化方式：自发转化、人工诱发转化。

自发转化（SpontaneousTranssformation）：指在未用任何的诱变剂处理的情况下，自发出现的转化现象。除细胞本身对环境较敏感之外，血清、病毒、培养基pH和培养温度等因素造成的。
人工诱发转化（Induced Transsformation）：指用化学、物理和生物等各种手段人为地诱发细胞发生转化。常用的化学试剂包括甲基硝基亚硝基肌、甲基甲磺酸、乙基甲磺酸、乙基亚硝基脲等，物理因素有紫外线、X射线、放射性核素等，生物因素包括猴病毒SV40、逆转录病毒、癌基因ras、端粒酶基因等。

3.培养细胞“一代”生存期

细胞“一代”（passage)：指从细胞接种到消化或分离再培养的这一段时间。

如某一细胞系为第15代细胞，即指该细胞系已传代15次。

它与细胞世代（generation）或倍增〔doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3－6次。

（1）潜伏期(latent phase)

包括悬浮期和贴壁期，是对传代操作所致损伤的恢复期和对新环境的适应期；
少有或无细胞分裂；
初代培养潜伏期约24～96h或更长;连续细胞系或肿瘤细胞潜伏期约6～24h；
其长短与细胞接种密度、细胞种类及种子细胞所处生长阶段、培养基组成、培养条件等有关。

（2）对数生长期(logarithmic growth phase)

细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳。持续3~5天；
细胞数量以指数函数规律增长，细胞数量的增长和增长速率与细胞数成正比；
细胞生长增殖状态可以根据细胞群体倍增时间和细胞分裂指数等来判断。
适于进行实验研究。

（3）稳定期(stagnate phase)

 又称生长停滞期。

特点：

细胞量和密度达到饱和，细胞生长速率大大下降，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。
及时分离培养、进行传代，否则细胞因中毒而发生死亡。

 产生机制：接触抑制、密度依赖性

（4）衰亡期(death phase)

达到稳定生长期的细胞群体，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率逐渐上升，以致细胞死亡数超过新细胞数，群体中活细胞数量下降。

注意：传代过晚将影响下一代细胞的生长，至少要再传1～2代，通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞，待细胞全部恢复后再用。

二、细胞培养的基本过程

组织取材（取材）——原代培养和传代培养——细胞纯化——细胞冻存复苏及运输。

（一）取材

注意事项：

严格无菌；
对于血液，脂肪，神经组织，结缔组织和坏死组织，取材细心去除，剪碎和切碎的过程，可避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液或缓冲液。
用锋利的器械切碎组织，1mm的组织小块。尽可能减少对细胞的机械损伤；
取材的组织最好尽快培养；
采用易培养的组织进行培养，成功率较高；

（二）原代培养与传代培养技术

1.原代培养常用方法：

组织块培养法：将组织块剪切成小块，直接接种到培养瓶的底部，采用薄层培养法或翻转干涸法进行培养。
分散细胞培养法：将细胞从组织中解离出来，形成细胞悬液，进行培养。

一般而言幼体组织比老龄组织，分化低的比分化高，肿瘤组织比正常组织易于培养。

(1) 组织块培养法

1)薄层培养法将组织块接种于培养瓶底部后，加入少量培养液,使组织块刚好浸在培养液中，又不至于漂浮,静置培养一段时间，待组织块贴壁后，再添加适量培养液继续培养。
2〉翻转干涸法将组织块接种于培养瓶底部后，将培养瓶反转过来，并将适量培养液加到非细胞生长面上，静置培养2~6 h，再轻轻地将培养瓶反转过来（让组织块贴壁），组织块浸在培养液中继续培养（图12-8)。

优点:操作简单;成功率较高;适合组织量较少时的原代培养。

缺点:细胞生长慢，培养时间长，并不是每个小块都能长出细胞。

(2) 分散细胞培养法

适用于大量细胞的培养，细胞的产量高，但步骤繁琐、易污染。

目前分散细胞的方法有机械分散法和消化分散法两种。

机械分散法：把剪切后的组织用吸管反复吹打或组织放入注射器内通过针头压出分离细胞；把组织置于不锈钢纱网中用钝物压取法。其中以压取法较多用。用于某些软组织如脑、胚胎、脾脏等。
缺点：对组织损伤大，细胞数量少。
消化分离法：消化分离法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。（胰蛋白酶：37℃，0.1~0.25%）。
优点：直接得到大量的活细胞；细胞很快生长成片；适用大量组织；原代细胞产量高。
缺点：步骤繁琐；易污染；一些消化酶价格昂贵，实验成本高。

2.传代培养

传代：当原初培养成功之后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养，这一操作过程称为传代。

贴壁细胞生长传代：

吸出培养瓶中旧的培养液；
加入胰蛋白酶和EDTA混合液；
吸出消化液，加入培养液终止消化；
吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，记数；
重新接种于新的培养瓶内培养；

请问:传代培养成功的关键是什么?

(1)传代时机细胞没生长到覆盖瓶底部的大部分表面前，不急于传代;
第一次传代，80-90%或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。
过早产量不足，过晚细胞状态不佳;
(2)掌握好酶消化的时间;
(3)首次传代时细胞接种数量要多-一些.

(2)悬浮生长细胞传代

离心法传代:离心( 1000转/分-800g)去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
直接传代法:悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/ 2- -2/ 3,然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

（三）细胞纯化（自学）

1.自然纯化

自然纯化利用某一细胞的增殖优势，在传代过程中通过自然淘汰，去除其他细胞生长，最后留下生长优势细胞，达到细胞纯化的目的。

2.人工纯化

利用人为手段造成对某一种细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞生长。

（1）酶消化法利用：上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，将两者分开。

（2）反复贴壁法：利用上皮细胞和成纤维细胞贴壁的难易程度不同，将两者分开。

（3）机械刮除法：原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞分为区域混杂生长，可采用此法去除不需要的细胞区域。

（4）克隆法

（5）流式细胞仪技术

（6）其他方法如密度梯度离心，免疫磁珠分选法等

（五）细胞的冻存复苏及运输

动物细胞长期保存的最佳温度：（液氮，-196℃）

1.冻存意义：

长期保存细胞，最大限度保存细胞活力；
防止细胞老化或恶性转变；
减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变；
减少人力、经费，减少污染。

慢冻快融

细胞直接冷冻：细胞内外形成冰晶，引起一系列不良反应。
减小细胞损伤的关键：减少细胞内冰晶的形成。
使用冷冻保护剂；
缓慢冷冻；
复苏过程应快融。

冷冻保护剂的应用：

v 加入冷冻保护剂，能大大提高冻存效果。
v 常用的是甘油或DMSO，渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，避免大的冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
v 保护剂的浓度在5~15%之间，常用10%。

3.细胞冻存步骤

预先配置冻存液：含有10%-20%血清培养基9份；DMSO或甘油1份；

取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×10^6～ 5 ×10^6细胞/ml）;

分装：每瓶1ml，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

（4）冻存

冻存注意事项：

取对数生长期细胞进行冻存，无微生物污染；
细胞浓度：达到10^6/毫升；
慢冻，低温保存；
合适的冷冻保护剂；
营养（血清、培养基）

4.细胞复苏方法

用快速融化的手段，以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。

程序：

（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。
（3）低速离心10分钟。
（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

细胞运输

培养细胞的交流、交换。

(1)冷冻储存运输用液氮或干冰贮存运输，效果好，需要特殊容器，较麻烦，且不宜长时间运输。 (2)充液法是一种较简单、使用较多的方法

二、动物细胞培养的基本方法（p239，自学为主)

悬滴培养法
培养瓶培养方法
培养板培养法
旋转管培养法
灌注小室培养法
克隆培养法

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一、基本概念

二、动物细胞体外培养特点（P243)

三、动物细胞培养的环境要求

四、体外培养细胞生物学特性

（一）体外培养细胞的生物学特点