imputation-文献：False signals induced by single-cell imputation（scRNA-seq插补引入的假阳性问题）

文章题目

False signals induced by single-cell imputation

中文名：

单细胞插补引起的假信号

文章地址：
https://f1000research.com/articles/7-1740/v2

评价插补方法：

SAVER,DrImpute,scImpute,DCA,MAGIC,knn-smooth

上述方法基于原理不同
SAVER，scImpute，drImpute基于模型，knn-smooth和MAGIC基于高斯平滑的思路，DCA是一种使用自编码器的基于深度学习的方法

评价指标构造方法：

1.构造简单的负二项数据集

1000个细胞 500个基因（平均表达确定在一个区间水平内）细胞类型2类

数据集中不存在dropout现象（没有0值）
数据集中基因 一半处于差异表达状态 另外一半独立绘制不存在差异表达
鉴定方法：通过SPearman相关性鉴定细胞间相关性，相关性确定后，用Bonferroni矫正相关性

假阳性设定：

不涉及DE基因或方向不正确的相关性被视为假阳性

结果

结果说明

所有插补方法都提高了检测低表达DE基因相关性的敏感性。然而，只有SAVER增强了低表达DE基因之间的相关性，而没有在独立绘制的基因之间产生假阳性基因相关性。

2.构造基于Splatter的数据模型

生成60个模拟scRNA-seq矩阵matrix

模拟数据集中的DE差异基因占比和dropout率各不相同，此外
每种方法的组也不相同

通过测试各组之间的差异表达基因来评估插补带来的假阳性可能
使用Kruskal Wallis检验来验证插补后数据的分布是否出现变化

真正的差异表达基因定义为：

gene大小为所有成对簇的最大对数2倍变化且在5%FDR后显著的基因才被称为DE gene

假阳性设定

构造的splatter数据集本身具有不同数据的原始值设定为reference 这个值可以作为ground truth使用
插补前后的数据集本身的DE gene 与真实情况的出入视为假阳性和假阴性来源

结果

结果解读

总的来说，当同时考虑敏感性和特异性时，基于模型的方法比平滑方法表现更好

3.对Tabula Muris数据集进行插补改装

从Tabula Muris中选择了6个10X 12个Smart-seq2的数据集

1.首先做归一化：

至少有两种细胞类型含有>5%的总细胞数目，过滤后有500-5000个细胞（表S1）。对每个数据集进行预处理，以删除占总细胞数小于5%的细胞类型，以及未分配给命名细胞类型的任何细胞。对基因进行过滤，以去除在不到5%的细胞中检测到的基因。

2.然后基于欧氏距离选择每种数据集中最相近的两个细胞类型

3.随后在选定细胞类型中计算基因差异表达

4.应用Mann-Whitney-U检验测试两种选定细胞类型之间的差异表达，评估每个插补引入的假阳性。采用Bonferroni多重检测校正，以确保预期总误报率低于1

5.留下不差异表达的基因，对其进行插补去噪

假阳性设定

插补去噪后进行上述步骤，差异表达基因如果存在即代表假阳性出现。

结果

结果解读

同一种方法在不同数据集上假阳性可能性不同。

4.构造可再现性的marker指标

上一步骤讲述的Tabula Muris数据集在该步骤继续使用
通过Mann-Whitney-U检验方法来确定标记基因Marker
Marker gene是一种不同于DE gene的指标每一个gene都会被分配一个自己的marker所属细胞类型
判定标准：将基因分配给AUC值最高的细胞类型
使用5%的FDR和超过特定阈值的AUC为每个输入数据集定义重要标记基因

通过这种方法可以将每个基因分配给数据集中的单个细胞类型而不是全局细胞类型

假阳性设定

设定为marker的gene在插补后是否是可再现的
可再现性分数定义为：
在两个数据集中都是显著标记的、也是同一细胞类型标记的标记的分数

结果

结果解读

存在大量的不可重现的标记marker gene 说明在不同数据集中的可定义为某个细胞类型的marker其实是有差别的。同一个marker gene在不同的数据集中属于不同的细胞类型。
如果不进行插补，两个数据集中95%的显著标记基因在同一细胞类型中高度表达。插补后，根据AUC阈值（可以划归为marker的阈值）的升高，这一数字大幅下降。在估算的Smart-seq2和10X Chromium数据集中，降低幅度阈值会导致更多标记分配给相互矛盾的细胞类型。

未经插补过的数据实际上获得了最高比例的一致性marker

插补之间的marker存在矛盾，同一个数据集中，通过不同插补方法分配给不同细胞类型的重要标记（FDR 5%）的比例亦不相同。
根据所用的插补方法，总共有5-35%的markergene 分配给不同细胞类型。
且存在偏向性一部分属于MAGIC、SAVER和dca，另一部分属于scImpute、DrImpute和knn-smooth。

同样的数据集经过不同的插补方法处理后，同一数据集的两种不同细胞（红，蓝）出现了DE基因的假阳性变化。例如，使用MAGIC插补后，Zfp606在PP细胞中的表达高于A细胞，但使用knn光滑插补后则相反。

总结

1.各类插补方法都会导致假阳性无可避免的存在
2.平衡sensitivity和specificity之间的基本平衡不可靠插补来打破
3.真实数据集相比于仿真数据集(splatter)变化更多，一些本来不会产生假阳性的方法在真实数据集上还是会产生假阳性
4.不同的插补方法既有利于敏感性，也有利于特异性，但没有一种方法能够全面改善差异表达的检测
5.当前单细胞RNASeq插补方法的基本局限性，即仅使用原始数据中的信息。因此，没有获得新的信息，这类似于简单地降低应用于数据的任何统计检验的显著性阈值
6.验证多个数据集或多个插补方法的结果再现性可以消除一些假阳性。