KEGG官方工具能够完成任何物种的KEGG注释！！！

写在前面

之前介绍过使用EggNOG-mapper对非模式物种快速完成KEGG注释的推文https://mp.weixin.qq.com/s/kIf6C2u3FID3ZeLtsB4eZQ，不过毕竟EggNOG-mapper是第三方软件，而且注释结果仍然存在一个Gene ID对应多个KO Number的情况，虽然对富集结果影响似乎不会太大，但是影响多少肯定是会有。

这里介绍KEGG官方提供的注释工具KofamKOALA，同样能够对任意物种进行KEGG注释，注释结果中Gene ID对应唯一一个KO Number，避免了大多数第三方注释工具一个ID对应多个KO Number的情况，使富集结果更加可靠！
本教程含「在线版」和「本地版」，满足各类注释场景。
KofamKOALA官网https://www.genome.jp/tools/kofamkoala/

一、网页版KofamKOALA

点击提交任务之后需要在邮件中二次确认，提交任务

注释完成之后，点击邮件中的链接

在结果页面中，可以直接下载注释结果，然后接着用TBtools进行富集分析
同时也提供了许多对注释结果的探索功能，比如查看注释上的KO Number详细信息，比对情况等。

二、本地化KofamKOALA

如果需要注释的序列太多，文件太大，使用网页版工具确实可能会太慢。这个时候当然是选择将其本地化！在本地根据服务器情况提高线程加速注释。

下载 KOfam 和 KofamScan

下载并解压KOfam

wget https://www.genome.jp/ftp/db/kofam/ko_list.gz
wget https://www.genome.jp/ftp/db/kofam/profiles.tar.gz
#下载完成之后解压
gunzip ko_list.gz
tar -xzvf profiles.tar.gz

下载并解压kofam_scan

wget https://www.genome.jp/ftp/tools/kofam_scan/kofam_scan-1.3.0.tar.gz
tar -xzvf kofam_scan-1.3.0.tar.gz

将kofam_scan加入环境变量

echo export PATH=/home/jiawei_li/tools/kofamscan/kofam_scan-1.3.0:\$PATH >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

安装依赖，KofamScan需要Ruby，HMMER和GNU Parallel

#版本需求
- Ruby >= 2.4
- HMMER >= 3.1
- GNU Parallel

conda安装Ruby，自己编译也行但是我比较懒折腾。。。

conda install -c conda-forge ruby

如果喜欢手动装Ruby，也可以试试，但也许会报错，需要进行一系列操作去安装

wget https://cache.ruby-lang.org/pub/ruby/3.1/ruby-3.1.0.tar.gz
tar -xzvf ruby-3.1.0.tar.gz
cd cd ruby-3.1.0
./configure
make
make install

安装hmmer

conda install -c bioconda hmmer

安装GNU Parallel

conda install -c conda-forge parallel

修改配置文件，指定依赖软件以及KOfam的路径

首先获取相关软件的路径（注意：配置文件中不需要指定Ruby的路径，但是需要确保Ruby加入了环境变量，能够直接调用）

which parallel  hmmscan
#/tools/parallel
#~/miniconda3/bin/hmmscan

使用官方模板，修改配置文件

cd kofam_scan-1.3.0
cp config-template.yml config.yml

注意，由于hmmscan和parallel都已经加入环境变量，可以直接调用，因此在配置文件中无需配置这两个软件的路径

# Path to your KO-HMM database
# A database can be a .hmm file, a .hal file or a directory in which
# .hmm files are. Omit the extension if it is .hal or .hmm file
profile: /home/jiawei_li/tools/kofamscan/profiles# Path to the KO list file
ko_list: /home/jiawei_li/tools/kofamscan/ko_list# Path to an executable file of hmmsearch
# You do not have to set this if it is in your $PATH
#hmmsearch: /home/jiawei_li/miniconda3/bin/hmmscan# Path to an executable file of GNU parallel
# You do not have to set this if it is in your $PATH
#parallel: /tools/parallel# Number of hmmsearch processes to be run parallelly
cpu: 8

对蛋白序列进行注释（注意：注释序列必须为蛋白序列）

exec_annotation -o test.querry2KO --cpu 8 --format mapper -E 1e-5 test.pep.fa

注意： --format参数在help中给出了四种，但主要有两种格式。

#help文档中的解释-f, --format <format>      Format of the output [detail]detail:          Detail for each hits (including hits below threshold)detail-tsv:      Tab separeted values for detail formatmapper:          KEGG Mapper compatible formatmapper-one-line: Similar to mapper, but all hit KOs are listed in one line

--format mapper对每一个Gene ID只保留最佳的KO Number，结果文件只含有Gene ID和KO Number的映射信息。

--format detail保留所有信息，包括Gene ID对应上的每一个KO Number，比对分数，E-value以及KO Number的详细信息等。

最后，拿到query2KO文件之后，就可以用其当背景文件，使用TBtools对基因集做富集分析啦

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