第一次听说START这款比对软件是因为其是ENCODE计划的御用软件，ENCODE计划(ENCyclopedia Of DNA Elements)又称人类基因组DNA元件百科全书计划，是2003年在人类基因组计划完成之后紧接着的又一个大型国际科研项目。

第二次听说则的由于Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis这篇发表于2017年的文章，主要是针对转录组各个分析流程的不同分析工具的比较，里面针对mRNA的比对方法总结了基于参考基因组的三款比对软件：TopHat，STAR和HASAT2。其中讲到STAT相比较其他两款软件有较高的唯一比对率；STAR会将没有paired mapping上的reads都剔除，避免single reads比对到基因组上；并且STAR对lower-quality(包括more soft-clipped和错配碱基)比对有较高的容忍度

第三次听说也是由于恰好需要使用GATK对RNA-Seq Call Variants，因而在GATK刚好查到一篇教程Calling variants in RNAseq

将reads比对至Reference上是采用STAR的STAR 2-pass模式，所以为了学习该教程，必须先学习如何使用STAR了 #### STAR的下载及安装

下载STAR，无须编译即可使用

wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/2.5.3a.tar.gz

tar -xzf 2.5.3a.tar.gz

cd STAR-2.5.3a

STAR的使用

作为一款比对软件，建index肯定是必不可少的一步

STAR --runThreadN 6 --runMode genomeGenerate \

--genomeDir ~/reference/index/STAR/mm10/ \

--genomeFastaFiles ~/reference/genome/mm10/GRCm38.p5.genome.fa \

--sjdbGTFfile ~/annotation/mm10/gencode.vM13.annotation.gtf \

--sjdbOverhang 100

这个命令参数也很好理解：

--runThreadN ：设置线程数

--genomeDir ：index输出的路径

--genomeFastaFiles ：参考基因组序列

--sjdbGTFfile ：参考基因组注释文件

--sjdbOverhang ：这个是reads长度的最大值减1，默认是100

然后进行比对

STAR --runThreadN 20 --genomeDir ~/reference/index/STAR/mm10/ \

--readFilesIn SRR3589959_1.fastq SRR3589959_2.fastq \

--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \

--outFileNamePrefix ./SRR3589959

--readFilesIn ：paired reads文件

--outSAMtype ：表示输出默认排序的bam文件，类似于samtools sort(还有--outSAMtype BAM Unsorted和--outSAMtype BAM Unsorted SortedByCoordinate)

--outFileNamePrefix ：输出文件路径即前缀

结果文件：

SRR3589959Aligned.sortedByCoord.out.bam

SRR3589959Log.final.out

SRR3589959Log.out

SRR3589959Log.progress.out

SRR3589959SJ.out.tab

可以通过samtools view SRR3589959Aligned.sortedByCoord.out.bam |less -S来查看对应文件的每列信息

前面12列一般也是规范的sam格式，最后一列attributes信息的话，STAR默认是输出NH HI AS nM attributes，这里需要注意的是HI，其表示多重比对的reads的起始位置，默认是以1开始算的，但是如果下游分析需要用到Cufflinks or StringTie的话，需要用--outSAMattrIHstart设置为0比对软件STAR的使用—高通量测序数据处理学习记录(一)

SRR3589959SJ.out.tab则是Splice junctions的一些信息，其中需要注意的是：对于junction的位置信息，STAR则是按照intron的起始和终止位置来定，而其他的一些软件则是按照exon的位置来决定的；至于每列代表的含义可以看mannul，很好理解

STAR 2-pass mode

为了发现更加灵敏的new junction，STAR建议使用2-pass mode，其能增加检测到的new junction数目，使得更多的splices reads能mapping到new junction。因此STAR先用一般参数做一遍mapping，收集检测到的junction信息，然后利用这已经annotated junction来做第二次mapping

STAR对于2-pass mode有新旧两种方式，比如original 2-pass 方法：

首先做一遍常规的比对，结果中会生成一个SJ.out.tab文件，如上面所提到的SRR3589959SJ.out.tab。然后用--sjdbFileChrStartEnd参数将所有样品的SJ.out.tab文件作为输入的annotated junction进行第二次建index

STAR --runThreadN 20 --runMode genomeGenerate

--genomeDir ~/reference/index/STAR/mm10/index_2-pass/ \

--genomeFastaFiles ~/reference/genome/mm10/GRCm38.p5.genome.fa \

--sjdbGTFfile ~/annotation/mm10/gencode.vM13.annotation.gtf \

--sjdbFileChrStartEnd SRR3589959SJ.out.tab SRR3589960SJ.out.tab SRR3589961SJ.out.tab SRR3589962SJ.out.tab \

--sjdbOverhang 100

然后用第二次建立的index再一次对每个样品进行STAR比对，以SRR3589959为例

STAR --runThreadN 20 --genomeDir ~/reference/index/STAR/mm10/index_2-pass/ \

--readFilesIn SRR3589959_1.fastq SRR3589959_2.fastq \

--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \

--outFileNamePrefix ./SRR3589959_2-pass

上述方法original方法适用于多样本和单个样本的处理，但是如果是per-sample(单个样本？)的2-pass mapping，可以直接用--twopassMode Basic参数将第两步mapping中的make index省去，直接再mapping

STAR --runThreadN 20 --genomeDir ~/reference/index/STAR/mm10/ \

--twopassMode Basic \

--readFilesIn SRR3589959_1.fastq SRR3589959_2.fastq \

--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \

--outFileNamePrefix ./SRR3589959

这个比常规的结果还多2个临时产生的文件夹(SRR3589959_STARgenome，SRR3589959_STARpass1)

至于bam文件则是跟上述的original 2-pass

STAR还有其他一些不太常用的参数，可以参看manual，Download后即可查看