从早期序列比对工具Needleman-Wunsch、Smith-Waterman到后来的Clustal算法，以及近几年的Muscle、MAFFT序列比对算法。算法在向更快、更精确、能处理更多数据这些方向进行缓慢而有力的发展。常用的在线序列比对工具主要由EMBL-EBI提供，包括但不限于Needle, Water, Clustal Omega, Muscle, Mafft, T-coffee等，以及NCBI提供的blast2seq工具；常用的序列相似性搜索工具有NCBI提供的BLAST、UCSC提供的BLAT等。EMBL-EBI与NCBI同时期也开发了一套序列相似性搜索工具FASTA，然后最终没能流行起来。BLAST一家独大，BLAT依赖UCSC占据一点小市场，FASTA的亲爹同时提供了FASTA及BLAST服务，可能现在说FASTA人们只会想到FASTA文件格式吧。EMBL-EBI提供大量的对比工具在线服务，并不代表其拥有这些工具的所有权。

按工具功能大致可以分为3类：配对序列比对工具，多序列比对工具以及序列相似性搜索工具。

配对序列比对是用来研究两条序列(核酸序列或者蛋白序列)之间功能、结构或者进化关系。

多序列比对工具当然也支持配对序列比对，不过更多的是用来比对3条及以上序列，研究序列之间是否同源以及序列间的进化关系。

序列相似性搜索工具主要是在一个序列数据库中查找一条序列，找出与查询序列最相似的序列。

配对序列比对工具

工具集网址：

https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/

这些可能是史前比对工具了，现在估计没有什么人在用了，可能也没人听过还有这样的工具存在。但是他大爷毕竟是他大爷，如果想比对两条序列全局情况，Needle仍是不错的选择，至于Smith-Waterman算法，在许多二代比对算法里仍可见，比如bwa-sw算法，Minimap2计算overlap时使用的也是Smith-Waterman算法；Smith-Waterman也拥有CUDA版本程序。

Needle比对工具

以Needle工具为例进行一下简单的演示，其提供了核酸及蛋白比对两个版本，比对不同类型的序列需要选择不同的工具。Needle是全局比对工具，将两条序列全部内部进行比对并展示。

1. 打开Needle核酸比对工具页面

https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html

2. 输入两条需要比对的序列

一个文本框里输入一条FASTA记录，其他参数不需要调整。

3. 查看结果

Needle的结果看起来是非常友好的，类似于NCBI BLAST显示结果，

多序列比对工具

工具集网址：

https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/

该主页提供了多款多序列比对工具，其中Clustal Omega结果形式是全局比对形式，但是算法还是局部比对算法，不建议在分子进化树分析过程使用Clustal相关程序，因为其速度及准确度均逊色于下述的MAFFT及MUSCLE。

下表列出了常用的多序列比对工具，在平时学习或者工作中建议使用MAFFT或者MUSCLE进行多序列比对。

MAFFT比对工具

MAFFT是2002年开发的一款快速的局部/全局多序列比对工具，与之相对的是2004年开发的MUSCLE多序列比对工具，在网页使用过程中，两者差异不明显，但是MUSCLE在比对数百条、数千条序列时，速度较慢，这时候使用MAFFT效果会好一点。

1. 打开MAFFT主页

https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/

2. 输入自己想要进行比对的多序列

支持2条以上序列比对，目前EMBL-EBI提供的网页版本MAFFT最大支持500条序列且文件大小不超过1MB(差不多1,000,000bp的碱基)。如果自己提交的文件较大，可以在提交时勾选Be notified by email。这样在比对完成时，EMBL-EBI会邮件通知你比对结果。

3. 查看结果

提交任务，过一段时间后就可以查看到比对结果了。其中Phylogenetic Tree可以查看分子进化树。

不同序列比对工具对比

其他工具使用方式与MAFFT一致，相对于ClustalW/Clustal Omega，MAFFT及MUSCLE比对结果无计数。但是MAFFT及MUSCLE在处理INDEL时，效果比ClustalW/Clustal Omega要好。

相同两条序列不同软件比对结果

可以很明显的看出各种工具对INDEL的处理，这主要是不同工具使用算法不同有关。Clustal，Water及blast2seq，在遇到Gap及Gap持续延长时，比对分值线性下降，而其他几种算法在遇到Gap及Gap持续延长时，比对分值会下降但不会低于0，不会线性下降。

序列相似性搜索工具

工具集网址：

https://www.ebi.ac.uk/Tools/sss

EMBL-EBI提供了FASTA及BLAST两款序列相似性搜索工具，不过序列相似性工具还是使用NCBI的BLAST以及UCSC的BLAT比较好。

NCBI BLAST

BLAST是目前最常用的生信工具之一，NCBI围绕BLAST开发了大量的周边工具，比如引物设计及特异性验证工具Primer-BLAST。

1.打开BLAST主页

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

其提供了4款BLAST子工具，常用的是核酸BLAST以及蛋白BLAST，点击核酸BLAST进入工具内部。

2. 选择适合的参数进行搜索

3. 搜索结果查看

有疑问可以点击整个页面右上角的HELP，进行个人自助。

4. 图形化浏览比对结果

这里又可以使用NCBI强大的基因组浏览功能了，可以添加自己想要的track进行数据关联展示，可惜好多人不太喜欢这个功能。

UCSC BLAT

1.打开BLAT主页

https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat

2. 选择合适参数进行序列搜索

3. 搜索结果查看

详细结果支持两种查看方式：基因组浏览器以及文本形式。基因组浏览器形式可以查看全局比对情况，以及匹配区域在基因组中的位置、注释等情况，文本形式可以详细的查看比对结果。

4. 基因组浏览器查看比对结果

5. 文本形式比对结果

BLAT更多体现的是一个定位功能，将查询序列定位到目标基因组上，而BLAST更加的是搜索功能，从序列数据库中搜索出与查询序列接近的目标序列。

总结：

对于链相反的序列比对建议使用blast2seq；

对于序列相似，想要查看序列全局比对的建议使用needle及MAFFT；

对于多条序列比对，建议使用MAFFTT；

实在特别想要Clustal计数形式结果，建议使用Clustal Omega或者Needle；

想做多条序列分子进化树，建议MAFFT；

未知序列搜索，想要研究序列功能可以使用blast，速度稍慢，但搜索库数据量大；

某一物种未知序列定位，建议使用blat，速度快。

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