基因编辑， “何方神圣”

基因编辑是一种对靶基因或转录产物进行敲除、插入和定点突变等精确修饰的基因工程技术，主要通过人工核酸酶实现对基因组的特定基因序列的敲除、插入或精确修饰。目前，主要有三大基因编辑技术，包括：锌指核酸酶 (Zinc finger nucleases; ZFNs) 技术，转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like (TAL) effector nucleases; TALENs) 技术和 CRISPR/Cas9 技术。

ZFNs 是最较早用于基因组编辑的人工合成的限制性内切酶，该酶是异源二聚体，包含 DNA 结合锌指蛋白 (ZFP) 结构域和非特异性 FokI 核酸酶结构域。DNA 切割域的 FokI 核酸酶必须二聚化以切割 DNA。该技术已被用于修饰各种生物体内的内源性基因。

与 ZFNs 的模块化结构一样，TALENs 的羧基末端也含有 FokI 核酸酶结构域，它借助 TALEs (来源于植物致病性黄单胞菌属细菌) 来识别特异性 DNA 碱基对。相较于 ZFNs 技术，其优势在于可以定点识别靶基因，从而使得基因编辑更加准确高效，其脱靶效应以及细胞毒性也得到了显著改善。

图 1. 不同基因编辑手段的对比

2020 年，两位女性科学家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因发现 CRISPR/Cas9 基因剪刀，而获得 2020 年诺贝尔化学奖。

CRISPR/Cas 系统由一小段 RNA 和一种高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 组成的系统，该技术不像 TALENs 技术和 ZFNs 技术是依赖于蛋白与靶基因之间的识别，而是由 sgRNA 和靶基因之间形成复合物，从而完成特定基因序列的编辑。

CRISPR/Cas9 技术切割效率相对较高且操作简单，并且可以同时进行多位点的编辑。总之，三种不同的基因编辑技术都有其各自的特点。今天小 M 的“重头戏”，CRISPR/Cas9。

CRISPR/Cas9 的调控机制

在细菌及古细菌中，CRISPR 系统共分成 3 类，其中 I 类和 Ⅲ 类需要多种 CRISPR 相关蛋白 (Cas 蛋白) 共同发挥作用。而来自 Streptococcus pyogenes 的 Ⅱ 型系统只需要一种 Cas 蛋白 (Cas9) 即可发挥核酸内切酶活性。因此，CRISPR/Cas9 系统应用最为广泛。CRISPR/Cas9 系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞。

■ 第一步：捕获外源 DNA

Cas9 蛋白包含两个核酸酶结构域：切割非互补 DNA 链的 RuvC 结构域和切割互补 DNA 链的 HNH 结构域 (如图 2a)。

噬菌体等外源 DNA 入侵时，CAS 蛋白复合物通常识别 3' 端含 NGG 的前间隔序列邻近基序 (PAM) 区域。然后，侵入的噬菌体或质粒释放的短 DNA 片段(称为 Protospacer)，插入宿主 CRISPR 位点中 (由重复序列隔开)。

■ 第二步：crRNA 合成

CRISPR 序列转录，形成前体 CRISPR RNA (pre-crRNA)。Cas9 及 RNase III 在 tracrRNA 与 pre-crRNA 上的重复序列配对形成双链 RNA 的条件下，对 pre-crRNA 进行剪切，形成成熟的 tracrRNA-crRNA 双链 RNA (即 sgRNA)。Cas9 核酸酶和 sgRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。

■ 第三步：靶向干扰

当外源 DNA 再次进入细胞时，Cas9 蛋白携带sgRNA，去识别外源 DNA 的 Protospacer (前间隔序列)，并与之结合，通过 Cas9 解旋酶和核酸酶对靶基因进行剪切。造成靶基因 DNA 的双链断裂 (DSB)，从而达到干扰靶基因表达的目的，在修复断裂同时引入基因敲除或敲入。

图 2. 通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 内源性修复双链 DNA 断裂[2]

综上，CRISPR 技术主要是利用位点特异 Cas 核酸酶在基因组靶位点处引入 DNA DSB，再经细胞自身的非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组修复 (HDR) 对 DSB 进行修复，最终实现目标基因敲除和碱基编辑等基因组遗传修饰。

CRISPR/Cas9 的小分子调控策略

CRISPR 技术在疾病治疗、基因功能调控、药物研发等多个方面具有广阔的应用前景，但也存在脱靶、基因毒性等副作用问题。由于 Cas9 蛋白和 sgRNA 在其自身活性、识别位点及结合能力等方面的不同特性，因此在应用中可以通过对 Cas9 蛋白酶以及与靶 DNA的结合进行有效的调控。目前，如：遗传调节、小分子激活剂、小分子抑制剂、生物响应性输送载体以及 CRISPR/Cas9 系统的光/热/超声/磁激活等方法已被研究开发。

■ 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略

可通过添加小分子来控制 Cas9 的构象变化，来实现对 Cas9 蛋白活性的时空控制。

案例 1：当内含肽插入 Cas9 蛋白的不同位点，Cas9 核酸酶失活；添加 4-HT (4-hydroxytamoxifen)，通过构象变化和自切割反应去除内含肽，可重新激活 Cas9 蛋白（图 3a）。根据内含肽的插入位点，Cas9 的激活效率 3 倍到 10 倍不等，与野生型 Cas9 相比，这种调控策略可增加开/脱靶效应比率。

图 3. 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略[9]

a：通过 4-HT 结合，恢复失活的 Cas9 活性；b：Cas9 和雌激素受体 (ERT2) 的融合被分离在细胞质中，通过添加 4-HT 使得融合物进入细胞核，形成 Cas9/sgRNA 复合物

案例 2：基于化学诱导的 Cas9 蛋白分裂片段的二聚化。Zetsche 等人设计了不同的分裂位点 (Arg535 和 Glu573) 生成分裂 Cas9 (split-Cas9) 蛋白，同时产生 C 端和 N 端Cas9 片段 (可分别与 FK506 结合蛋白 (FKBP) 和 FKBP 雷帕霉素结合结构域 (FRB) 结合)。这种方法通过雷帕霉素诱导的异源二聚作用实现了 split-Cas9 的条件重构和激活。

图 4. 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略[9]

■ 小分子抑制剂控制 Cas9 活性的策略

由于 Cas9 活性的升高和持续可能会导致脱靶效应、染色体易位和遗传毒性，因此在目标编辑后，Cas9 核酸酶活性必须迅速限制在一个狭窄的时间范围内。

如下图 5 所示，DHFR (ER50)是一个不稳定的结构域，可快速靶向 Cas9 蛋白进行蛋白酶体介导的 Cas9 降解，但添加小分子抑制剂甲氧苄氨嘧啶 (TMP) 或 4-OHT 后可以使其稳定。用 Cas9-DHFR 或 Cas9-ER50 系统编辑 VEGFA 基因时，用不同剂量的TMP 或 4OHT 剂量依赖性控制靶向 VEGFA 基因的复合物 Cas9-DHFR (ERR50) 的靶向和非靶向活性。

图 5. 小分子抑制剂控制 Cas9 活性的策略[9]

总结

CRISPR-Cas9 系统已成为一种在任何细胞基因组的精确位置进行修改的有效工具。Cas9 介导的 DNA 切割后发生的主要细胞修复途径是错误的非同源末端连接 (NHEJ) 途径。同源定向重组 (HDR) 的效率远远低于 NHEJ。因此，降低 NHEJ 的频率，同时增加 Cas9 介导的 DNA 切割后的 HDR 效率，从而提高基因组编辑的整体效率和精准度成为科学家关注的焦点。与此同时，通过研究人员的不断努力，生物活性小分子提供了一种简单而有效的调控策略，可进一步拓宽精确基因组编辑的应用范围。

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参考文献

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