[总结] 单颗粒分析(SPA, Single particle analysis)
Reference: 维基百科
概述
单颗粒分析是一组相关的计算机图像处理技术,用于分析来自透射电子显微镜(TEM)的图像。 开发这些方法是为了改善和扩展可从颗粒样品(通常是蛋白质或其他大型生物实体,例如病毒)的TEM图像中获得的信息。 染色或未染色颗粒的单个图像噪声很大,故难以解释。 将相似颗粒的多个数字图像组合在一起,就可以得到具有更强更容易解释的特征的图像。 该技术的扩展使用单颗粒方法来构建粒子的三维重构。 利用冷冻电镜首先针对高度对称的病毒,实现了亚纳米分辨率和近原子分辨率生成重建体,现在对较小的不对称蛋白质也可以生成重建体。
相关技术
单颗粒分析的对象可以是负染样品和玻璃冰样品。 尽管正在开发处理构象异质性颗粒的技术,但是单颗粒分析方法通常依赖于均质的样品。现在通常使用直接电子探测器收集图像。 图像处理是使用专用软件程序执行的,这些程序通常在多处理器计算机集群上运行。根据样品和所需结果,可以完成二维或三维处理的各个步骤。
Alignment and classification(分类与对齐)
生物样品,特别是包埋在玻璃状薄冰中的样品,对辐射高度敏感,因此只能使用低电子剂量对样品成像。这种低剂量以及所用金属标记的变化(如果使用的话)意味着相对于所观察到的颗粒所给出的信号,图像具有较高的噪声。通过将几张相似的图像彼此对齐,然后对其求平均,可以获得具有较高信噪比的图像。由于噪声大部分是随机分布的,并且基础图像的特征是恒定的,因此,通过对多个图像上每个像素的强度求平均值,只会增强恒定的特征。通常,通过计算互相关是将一个图像映射到另一个图像的最佳对齐方式(平移和平面内旋转)。
但是,显微照片通常包含多个不同方向和/或构象的粒子,因此要获得更具代表性的图像平均值,需要一种将相似粒子图像进行分组的方法。通常使用几种数据分析和图像分类算法中的一种来执行此操作,例如多变量统计分析和分层上升分类(hierarchical ascendant classification) 或k均值聚类。
通常使用数以万计的粒子图像的数据集,并且为了获得最佳解决方案,使用对准和分类的迭代过程,从而将通过分类产生的强图像平均值用作参考图像,以进行整个数据集的后续对准。
Image filtering(图像滤波)
图像滤波(带通滤波)通常用于减少图像中高和/或低空间频率信息的影响,这可能会影响对齐和分类过程的结果。 这在负染图像中特别有用。 该算法利用快速傅立叶变换(FFT),通常在倒数空间中采用高斯形状的软边掩模来抑制某些频率范围。 高通滤波器消除了低空间频率(例如斜坡或渐变效果),而较高的频率则保持不变。 低通滤波器消除了高空间频率特征,并在精细细节上产生模糊效果。
Contrast transfer function(衬度传递函数)
由于电镜成像的性质,使用显着的欠焦可以获得明亮的TEM图像。 这与显微镜镜头系统固有的功能一起,会使收集到的图像模糊,这是点扩散功能。 成像条件的组合效应称为对比度传递函数(CTF),可以在数学上近似为倒数空间中的函数。 诸如相位翻转和幅度校正/维纳滤波之类的专门图像处理技术可以(至少部分地)校正CTF,并允许高分辨率重建。
Three-dimensional reconstruction(三维重构)
透射电子显微镜图像是物体的投影,显示了整个物体的密度分布,类似于医学X射线。通过使用投影切片定理,可以通过组合从一个视角范围拍摄的物体的许多图像(2D投影)来生成物体的三维重建。理想情况下,玻璃冰中的蛋白质采用随机分布的方向(或视角),如果使用了大量的粒子图像,则可以实现各向同性的重建。这与电子断层扫描相反,电子断层扫描由于样品/成像设置的几何形状而限制了视角,从而实现了各向异性的重建。滤波反投影是在单粒子分析中生成3D重建的一种常用方法,尽管存在许多替代算法。
在进行重建之前,需要估计每个图像中对象的方向。目前已经开发出几种方法来计算每个图像的相对欧拉角。一些基于等价线(共同的一维投影和正弦图),另一些则使用迭代投影匹配算法。后者以一个简单的低分辨率3D初始模型开始重建,并将实验图像与该模型的投影进行比较,并创建一个新的3D模型以引导至最终结果。
还可以利用固有的螺旋对称性,对螺旋样品(例如烟草花叶病毒)进行3D重建。实际空间方法(将螺旋线的各个部分作为单个粒子进行处理)和倒数空间方法(使用衍射图样)均可用于这些样品。
Tilt methods(倾斜法)
显微镜的样品台可以倾斜(通常沿单个轴倾斜),从而允许采用称为随机锥形倾斜的单粒子技术。标本的区域在零倾角和高倾角(约60-70度)时成像,或者在相关的正交倾斜重建方法中,成像时为+45度和-45度。选择在两个不同的倾斜下对应于同一物体的成对的粒子对(倾斜对),并且通过遵循在随后的对齐和分类步骤中使用的参数,可以相对容易地生成三维重建。这是因为从倾斜几何学已知每个粒子的视角(定义为三个欧拉角)。
由随机圆锥形倾斜产生的3D重建会因方向范围受限而导致信息丢失。被称为缺失锲现象,这会导致3D地图中的变形。但是,通常可以通过组合几个倾斜重建来解决锥体丢失的问题。倾斜法最适合于负染样品,可用于以优选方向吸附到碳载体膜上的颗粒。带电或束流引起的运动使得在玻璃冰中收集样品的高倾斜度图像具有挑战性。
Map visualization and fitting(投影图可视化)
可以使用各种软件程序查看3D地图。 这些通常使用户能够将亚基的蛋白质坐标(来自X射线晶体学或NMR的结构)手动停靠到电子密度中。 几个程序也可以在计算上适合子单元。
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