浅析单因素方差分析中的多重比较

本脚本侧重于单因素方差分析中多重比较方法的运用;
就不展示数据正态性及齐次性的运算了(默认都符合，一般理化数据是都符合的);
有的人喜欢用Tukey检验，但会遇到一些不符合预期的问题;
让我们抽丝剥茧的来理清这些个问题,尤其注重阅读下面的讨论说明(说不定你就遇到过这样的问题)；
这里用的数据涉及到多个α多样性，多个的处理(若你是做基因你可以理解成多个采样地的多个基因)同时进行多重比较。

代码和测试数据下载：http://210.75.224.110/github/Note/R/multcomp.zip

library(ggplot2)
library(ggprism)
dat <- read.table('./alpha.txt',row.names = 1,header = T,stringsAsFactors = F)#读入α多样性数据
head(dat, n = 3)
design <- read.table('./metadata.tsv',row.names = 1,header = T,stringsAsFactors = F)#读入试验设计文件
head(design, n = 3)
dat <- merge(dat,design,by='row.names')#按照行名合并文件
head(dat, n = 3)
library(reshape2)
dat <- melt(dat,id.vars = -c(2:7),variable.name = 'alpha')#宽数据变长数据
head(dat, n = 3)
dat$alpha <- as.factor(dat$alpha)#将α列转化成因子
names(dat)[4] <- 'v'#给value重新赋列名
head(dat, n = 3)

函数和参数简介

函数参数设置：

• data就是上面整好的数据,

• group是你的分组信息列，比如α多样性的种类(或不同的基因),

• compare是每个α多样性要比较的不同处理(或每个gene要比较的不同处理),

• value 值就是要比较的α多样性/gene拷贝数的数值。

整体思想如下(例如本数据)：
首先给输入数据dat，根据alpha列分成不同的小子集，每个小子集比较不同Group下v值的差异情况，最后汇总输出。

# 1 -----------------------------------------------------------------------
ONE_Tukey_HSD1 <- function(data,group,compare,value){library(multcomp)#Tukey检验需要用到这个包来标显著性字母标记a <- data.frame(stringsAsFactors = F)#做一个空的数据框type <- unique(data[,group])#统计需要运行多重比较的次数for (i in type)#进行type次多重比较{g1=comparesub_dat <- data[data[,group]==i,]#根据指定的i去取相应的数据集出来#fit <- aov(sub_dat[,value] ~ sub_dat[,compare] )names(sub_dat)[names(sub_dat)==compare] <- 'g1' ## 重命名方便后面使用names(sub_dat)[names(sub_dat)==value] <- 'value' ## 重命名方便后面使用sub_dat$g1 <- factor(sub_dat$g1)#将列转化成因子以进行多重比较fit <- aov(value ~ g1,data = sub_dat )#方差分析#Tukey_HSD = TukeyHSD(fit, ordered = TRUE, conf.level = 0.95)options(warn = -1)tuk <- cld(glht(fit, alternative = 'two.sided', linfct = mcp(g1 = 'Tukey')), decreasing = TRUE)#Tukey检验多重比较Tukey.labels <- data.frame(Letters=tuk$mcletters$Letters, stringsAsFactors = FALSE)#获取多重比较字母标注Tukey.labels$compare = rownames(Tukey.labels)## 提取字母分组行名为group组名Tukey.labels$type <- imean_sd <- merge(aggregate(sub_dat[['value']],by=list(sub_dat[,'g1']),FUN=sd),#获取数据标准差aggregate(sub_dat[['value']],by=list(sub_dat[,'g1']),FUN=mean),by="Group.1"#获取数据均值)names(mean_sd) <- c('compare','std','mean')#列名重命名a <- rbind(a,merge(mean_sd,Tukey.labels,by='compare'))#合并数据}names(a) <- c(compare,'std','mean','Letters',group)#列名重命名return(a)
}# 2 -----------------------------------------------------------------------ONE_Tukey_HSD2 <- function(data,group,compare,value){library(multcompView)a <- data.frame(stringsAsFactors = F)type <- unique(data[,group])for (i in type){g1=comparesub_dat <- data[data[,group]==i,]#fit <- aov(sub_dat[,value] ~ sub_dat[,compare] )## 重命名方便后面使用names(sub_dat)[names(sub_dat)==compare] <- 'g1'names(sub_dat)[names(sub_dat)==value] <- 'value'sub_dat$g1 <- factor(sub_dat$g1)fit <- aov(value ~ g1,data = sub_dat )Tukey_HSD = TukeyHSD(fit, ordered = TRUE, conf.level = 0.95)options(warn = -1)tuk <- multcompLetters2(value ~ g1, Tukey_HSD$g1[,"p adj"], sub_dat)#tuk <- cld(glht(fit, alternative = 'two.sided', linfct = mcp(g1 = 'Tukey')), decreasing = TRUE)Tukey.labels <- data.frame(tuk['Letters'], stringsAsFactors = FALSE)## 提取字母分组行名为group组名Tukey.labels$compare = rownames(Tukey.labels)Tukey.labels$type <- imean_sd <- merge(aggregate(sub_dat[['value']],by=list(sub_dat[,'g1']),FUN=sd),aggregate(sub_dat[['value']],by=list(sub_dat[,'g1']),FUN=mean),by="Group.1")names(mean_sd) <- c('compare','std','mean')a <- rbind(a,merge(mean_sd,Tukey.labels,by='compare'))}names(a) <- c(compare,'std','mean','Letters',group)return(a)
}

ONE_Tukey_HSD1函数

这个函数核心
是cld(glht(fit, alternative = ‘two.sided’, linfct = mcp(g1 = ‘Tukey’)), decreasing = TRUE),
不会出现c>b>a情况(因为decreasing = TRUE,当然有的人喜欢这样标,)和乱标字母(比如对于mean最低的点
并不一定标记成c(a>b>c时)或并不一定标记成a(c>b>a时),其只能保证有差异的数据一定是不同字母),
但是多重比较出现“ac”标注，没法解决。

ONE_Tukey_HSD2函数

而ONE_Tukey_HSD2核心是这个 multcompLetters2(value ~ g1, Tukey_HSD$g1[,”p adj”], sub_dat),
multcompLetters2这个函数隶属于multcompView包，与 multcompLetters不同的是
multcompLetters2可以接受formula，而multcompLetters只接受一个两两比较的p值的数据框,
且可能多重比较时出现“ac”标注,以及出现c>b>a情况和乱标字母(比如对于mean最低的点
并不一定标记成c(a>b>c时)或并不一定标记成a(c>b>a时),其只能保证有差异的数据一定是不同字母)。

当然多重比较好多方法，不要局限于一种方法,
例如下面的第三种可以用library(agricolae)包中的LSD检验(用的“BH”校正),

当然也可以用library(agricolae)包中的
【Duncan法】(新复极差法)(SSR);
【SNK法】(Student-Newman-Keuls);
【Scheffe检验】;

这三种多重比较方法同LSD检验的用法一样都可以避免出现上面提到的三种情况即：

1、 a、b、c的顺序不会出现c>b>a;

2、不会出现乱标字母(比如对于mean最低的点并不一定标记成c(a>b>c时)或
并不一定标记成a(c>b>a时)，其只能保证有差异的数据一定是不同字母);

3、多重比较时出现“ac”标注。

ONE_LSD函数

# 3 -----------------------------------------------------------------------
ONE_LSD <- function(data,group,compare,value){library(agricolae)a <- data.frame(stringsAsFactors = F)type <- unique(data[,group])for (i in type){# sub_dat <- subset(data,group == i)sub_dat <- data[data[,group]==i,]# fit <- aov(value ~ compare,sub_dat)fit <- aov(sub_dat[,value] ~ sub_dat[,compare] )out <- LSD.test(fit,'sub_dat[, compare]',p.adj='BH')#进行了p值校正#out$groups就可获取多重比较字母列表out$groups$type <- iout$groups$compare <- rownames(out$groups)a <- rbind(a,merge(out$means[,1:2], out$groups,by='sub_dat[, value]'))}names(a) <- c('mean','std','lsd',group,compare)return(a)
}

alpha多样性在不同处理下的差别

运行，这里拿alpha多样性测试，看不同alpha多样性在不同处理下的差别。

#1
#df1 <- ONE_Tukey_HSD1(data=dat,group='alpha',compare='Group',value='v')
df1 <- ONE_Tukey_HSD1(dat,'alpha','Group','v')

在此可以查看各个α多样性下不同处理间的多重比较字母标注结果，这也是本脚本的亮点之一

数据量很大的情况下，可以直接查看差异情况，不用一个个的做出图再点开看，很是方便。

df1

p1 = ggplot(dat)+geom_boxplot(aes(x=Group,y=v,fill=Group))+geom_text(data=df1,aes(x=Group,y=mean+1.3*std,label=Letters))+facet_wrap(.~alpha,scales = "free_y")+ labs(x='Group',y='AlphaDiv')+ggprism::theme_prism()+theme(axis.text.x = element_text(angle = 45))

本图一张即可包含所有数据情况，方便查看

p1

#2
#df2 <- ONE_Tukey_HSD2(data=dat,group='alpha',compare='Group',value='v')
df2 <- ONE_Tukey_HSD2(dat,'alpha','Group','v')
df2

p2 = ggplot(dat)+geom_boxplot(aes(x=Group,y=v,fill=Group))+geom_text(data=df2,aes(x=Group,y=mean+1.3*std,label=Letters))+facet_wrap(.~alpha,scales = "free_y")+ labs(x='Group',y='AlphaDiv')+ggprism::theme_prism()+theme(axis.text.x = element_text(angle = 45))
p2

#3
#df3 <- ONE_LSD(data=dat,group='alpha',compare='Group',value='v')
df3 <- ONE_LSD(dat,'alpha','Group','v')
df3

p3 = ggplot(dat)+geom_boxplot(aes(x=Group,y=v,fill=Group))+geom_text(data=df3,aes(x=Group,y=mean+1.3*std,label=lsd))+facet_wrap(.~alpha,scales = "free_y")+ labs(x='Group',y='AlphaDiv')+ggprism::theme_prism()+theme(axis.text.x = element_text(angle = 45))
p3

Output figure width and height
Letter纸图片尺寸为单栏89 mm，双栏183 mm，页面最宽为247 mm
推荐比例16：10，即半版89 mm x 56 mm; 183 mm x 114 mm

# ggsave("./alpha1.pdf", p1, width = 350, height = 200, units = "mm")
# ggsave("./alpha2.pdf", p2, width = 350, height = 200, units = "mm")
# ggsave("./alpha3.pdf", p3, width = 350, height = 200, units = "mm")

参考资料

EasyAmplicon/script/alpha_boxplot.R

差异分析、显著性标记及统计作图的自动实现R代码示例

multcompView: Visualizations of Paired Comparisons

作者：flyfly、旭日阳光

责编：马腾飞 南京农业大学

审核：刘永鑫 中科院遗传发育所

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