目录

前言

一、软件安装

二、创建环境及安装软件

1.创建环境 chipseq

2.chipseq 环境下安装软件

三、具体分析步骤

1.数据来源

2.下载数据并重命名

3.fastq 文件转换（--sra-id 此步骤把 SRR 的名称改掉，加快运行速度，速度非常快）

4.质控

4.1 trim_galore

4.2 FastQC质控报告生成（旧的数据）

5.bowtie2比对(15min/file)

6.samtools sam 转换 bam

6.1view &sort

6.2 index

7.bamCoverage BW转换 bam 转换成 bw

8.IGV查看 bw文件 peak

9.MACS2 callpeak

10.MACS2 差异分析（2021-10-15 待完善）

11.Homer 分析 motif

11.1查看所有的 list:

11.2下载注释信息

11.3 Create a tag directory

11.4 Differentially Bound Peaks（找差异peak）

11.5 Annotate peaks（Peak注释）

用 R 把差异peak 和 Peak 注释合并：fread,merge 函数

11.6 其他功能

12. ROSE 寻找超级增强子 SE（super enhancer）

12.1 参考教程： ROSE | 超级增强子鉴定

12.2 ROSE 安装见上

12.3 ROSE 寻找 SE

前言

自己做笔记自己看的

一、软件安装

设备：mac m1 电脑

  • 软件程序安装
  • 参考教程Macbook Pro M1芯片Python开发环境配置_朝歌晚酒南栀雪的博客-CSDN博客
    • xcode
    • item2
    • git
    • homebrew 
      brew install wget #安装 wget
    • anaconda-pkg

​                 ​​​​​​ Anaconda | Individual Edition  下载链接

Installing on macOS — Anaconda documentation 帮助链接

pycharm CE

二、创建环境及安装软件

1.创建环境 chipseq

conda  create -n chipseq  python=3conda activate chipseq #激活环境conda deactivate

2.chipseq 环境下安装软件

ps:一项一项安装，不然容易卡住

conda install -y bioconda parallel-fastq-dump  #SRR→FASTQ 转换conda install -y trim-galore #质控conda install -y bioconda bowtie2 # fastq比对到 hg19brew tap homebrew/science brew install samtools #sam 转化为 bamconda install -y macs2 #峰值定量，差异分析conda install -y conda-forge libgfortran #macs2 差异分析辅助用conda install -y bioconda deeptools #可视化#包含 bamcoveragehttps://deeptools.readthedocs.io/en/latest/content/tools/bamCoverage.htmlIGV 下载https://software.broadinstitute.org/software/igv/download #可视化

ROSE 安装

https://bitbucket.org/young_computation/rose/src/master/ ROSE 下载
#把所有要处理的文件都放到 rose 文件夹：sorted.bam, bed,bam.bai
#创建 Python2.7conda  create -n rose  python=2.7conda activate rose

Homer安装

  • 公众号参考 HOMER | chipseq数据进行peaks的差异分析
  • homer安装： chipseq 环境下，conda install -c bioconda homer
    • 下载configureHomer.pl  http://homer.ucsd.edu/homer/configureHomer.pl
    • 文件放在想要安装 homer 的文件夹中，/Users/xusiqi/chip/homer
      • 目录文件夹中安装 homer :
perl configureHomer.pl -installopen -a TextEdit ~/.bash_profilePATH=$PATH:/Users/chucknorris/homer/bin/  #路径加入到系统路径中source ~/.bash_profile
  • perl configureHomer.pl -list #查看所有的 list

三、具体分析步骤

1.数据来源

使用数据Wang J, Zou JX, Xue X, Cai D et al. ROR-γ drives androgen receptor expression and represents a therapeutic target in castration-resistant prostate cancer. Nat Med 2016 May;22(5):488-96. PMID: 27019329

GSM1868876: C4-2B vehicle Input chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242690)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242690

GSM1868866: C4-2B vehicle AR chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242680)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242680

GSM1868862: 2nd time C4-2B vehicle AR chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242676)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242676

GSM1868864: 2nd time C4-2B vehicle Input chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242678)

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242678

2.下载数据并重命名

wget https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8557353/SRR8557353
mv     SRR8557353      input.h3k.conwget https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos3/sra-pub-run-20/SRR8557351/SRR8557351.1
mv  SRR8557351.1   ip.h3k.conwget https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos3/sra-pub-run-21/SRR8557354/SRR8557354.1
mv  SRR8557354.1   input.h3k.xywget https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8557352/SRR8557352
mv   SRR8557352     ip.h3k.xy

3.fastq 文件转换（--sra-id 此步骤把 SRR 的名称改掉，加快运行速度，速度非常快）

parallel-fastq-dump —sra-id input.h3k.con —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip
parallel-fastq-dump —sra-id ip.h3k.con   —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip
parallel-fastq-dump —sra-id  input.h3k.xy   —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip
parallel-fastq-dump —sra-id   ip.h3k.xy   —threads 35  —outdir out/ —split-files —gzip

4.质控

4.1 trim_galore

  • trim_galore（只能单线程）

    • Cutadapt:去接头，去除3端低质量碱基，去除长度太短的序列

      • report.txt
      • fq.gz(用来比对)
trim_galore input.h3k.con_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4
trim_galore input.h3k.xy_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4
trim_galore ip.h3k.con_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4
trim_galore ip.h3k.xy_1.fastq.gz  -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4

4.2 FastQC质控报告生成（旧的数据）

  • fastqc -o /Users/xusiqi/CHIP/out -t 6 /Users/xusiqi/CHIP/out/SRR2242680_1_trimmed.fq.gz
  • fastqc -o /Users/xusiqi/CHIP/out -t 6 /Users/xusiqi/CHIP/out/SRR2242690_1_trimmed.fq.gz
  • fastqc -o 输出绝对路径 -t 线程数 输入文件绝对路径
  • -o 后面为文件输出绝对路径，-t 6(为线程数)， 最后为输入文件绝对路径；大约 5min/file

5.bowtie2比对(15min/file)

bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/input.h3k.con_1_trimmed.fq.gz  -S input.h3k.con.sam
bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/input.h3k.xy_1_trimmed.fq.gz  -S input.h3k.xy.sam
bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/ip.h3k.con_1_trimmed.fq.gz  -S ip.h3k.con.sam
bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U  /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/ip.h3k.xy_1_trimmed.fq.gz  -S ip.h3k.xy.sam

6.samtools sam 转换 bam

6.1view &sort

samtools view -S -b input.h3k.con.sam > input.h3k.con.bam
samtools sort input.h3k.con.bam -o input.h3k.con.sorted.bamsamtools view -S -b input.h3k.xy.sam > input.h3k.xy.bam
samtools sort input.h3k.xy.bam -o input.h3k.xy.sorted.bamsamtools view -S -b ip.h3k.con.sam >ip.h3k.con.bam
samtools sort ip.h3k.con.bam -o ip.h3k.con.sorted.bamsamtools view -S -b ip.h3k.xy.sam > ip.h3k.xy.bam
samtools sort ip.h3k.xy.bam -o ip.h3k.xy.sorted.bam

6.2 index

samtools index input.h3k.con.sorted.bam
samtools index input.h3k.xy.sorted.bam
samtools index ip.h3k.con.sorted.bam
samtools index  ip.h3k.xy.sorted.bam

7.bamCoverage BW转换 bam 转换成 bw

bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b input.h3k.con.sorted.bam -o input.h3k.con.sorted.bw
bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b input.h3k.xy.sorted.bam -o input.h3k.xy.sorted.bw
bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b ip.h3k.con.sorted.bam -o ip.h3k.con.sorted.bw
bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b ip.h3k.xy.sorted.bam -o ip.h3k.xy.sorted.bw

8.IGV查看 bw文件 peak

  • IGV 下载 Downloads | Integrative Genomics Viewer

    • IGV 打开 bw 文件

9.MACS2 callpeak

  • macs2 callpeak -t 实验 sorted.bam -c   对照inputsorted.bam -g hs -B -f BAM -n 输出名称（无后缀，简单命名） -q 0.05

    macs2 callpeak -t ip.h3k.con.sorted.bam -c   input.h3k.con.sorted.bam -g hs -B -f BAM -n con  -q 0.05
macs2 callpeak -t ip.h3k.xy.sorted.bam -c   input.h3k.xy.sorted.bam -g hs -B -f BAM -n xy -q 0.05

10.MACS2 差异分析（2021-10-15 待完善）

参考教程：

Call differential binding events · macs3-project/MACS Wiki · GitHub

需要的文件名

  • input.h3k.con.sorted.bam
  • input.h3k.xy.sorted.bam 
  • ip.h3k.con.sorted.bam   
  • ip.h3k.xy.sorted.bam

  • con_control_lambda.bdg

  • xy_control_lambda.bdg

  • con_treat_pileup.bdg  

  •  xy_treat_pileup.bdg

d-length

tags after filtering

macs2 predictd -i input.h3k.con.sorted.bam

macs2 predictd -i input.h3k.xy.sorted.bam

macs2 predictd -i ip.h3k.con.sorted.bam

macs2 predictd -i  ip.h3k.xy.sorted.bam

199

205

13313222

24184450

22342330

21410271

202

callpeak excle 表中就有

11.Homer 分析 motif

公众号参考 HOMER | chipseq数据进行peaks的差异分析

11.1查看所有的 list:

perl configureHomer.pl -list

11.2下载注释信息

perl configureHomer.pl -install hg19
#（安装hg19的GENOMES,会自动下载human数据，1.38G，多试几次，网速可达 6-7Mb)

11.3 Create a tag directory

  • homer 下新建一个 out 文件夹，在此路径下运行以下代码

    makeTagDirectory 文件夹名（tag directory）  -genome hg19(带绝对路径)  -checkGC  输入文件 sam（绝对路径）

  • 输入文件名：input.h3k.con.sam input.h3k.xy.sam  ip.h3k.con.sam    ip.h3k.xy.sam
  • makeTagDirectory  input.h3k.con  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/input.h3k.con.sam
makeTagDirectory input.h3k.xy  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/input.h3k.xy.sam
makeTagDirectory  ip.h3k.con  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/ip.h3k.con.sam
makeTagDirectory  ip.h3k.xy  -genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/ip.h3k.xy.sam

11.4 Differentially Bound Peaks（找差异peak）

getDifferentialPeaks <peak file> <target tag directory> <background tag directory> [options]

输入文件名：

con_peaks.narrowPeak  xy_peaks.narrowPeak
input.h3k.con   input.h3k.xy    ip.h3k.con     ip.h3k.xy

getDifferentialPeaks /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/con_peaks.narrowPeak ip.h3k.con/ input.h3k.con/ > con.diffpeaks.csv
getDifferentialPeaks /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/xy_peaks.narrowPeak ip.h3k.xy/ input.h3k.xy/ > xy.diffpeaks.csv

11.5 Annotate peaks（Peak注释）

Usage: annotatePeaks.pl <peak file | tss> <genome version>  [additional options...]

输入文件名：con.diffpeaks.csv    xy.diffpeaks.csv

annotatePeaks.pl con.diffpeaks.csv /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 > con.diffpeaks.anno.txt
annotatePeaks.pl xy.diffpeaks.csv /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 > xy.diffpeaks.anno.txt

用 R 把差异peak 和 Peak 注释合并：fread,merge 函数

11.6 其他功能

  • annotatePeaks.pl程序还可以用于创建显示相对于给定基因组特征(包括转录起始位点(TSS)或用户想要定义的任何其他区域)的相对读富集的直方图。由于TSS经常用于此目的，所以HOMER为TSS提供了一个内置注释(基于RefSeq转录本)。创建直方图的关键参数是“-hist #”和“-size #”选项，它们控制直方图的装箱大小和总长度。另一个重要的选项是“-d”，它指定要为哪些实验编译直方图。

    • annotatePeaks.pl tss hg19 -size 8000 -hist 10 -d h3k.con/ h3k.bay/ > output.txt
    • 用电子表格程序/Excel打开output.txt文件。将注意到第一列给出了到TSS的距离偏移量，然后是对应于每个实验的“覆盖率”、“+标记”和“-标记”的列。尝试用第一列作为X-Y线形图来查看模式。

12. ROSE 寻找超级增强子 SE（super enhancer）

12.1 参考教程： ROSE | 超级增强子鉴定

12.2 ROSE 安装见上

12.3 ROSE 寻找 SE


python ROSE_main.py -g HG19 -i xy_summits.bed -r ip.h3k.xy.sorted.bam -c input.h3k.xy.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/xy
python ROSE_main.py -g HG19 -i con_summits.bed -r ip.h3k.con.sorted.bam -c input.h3k.con.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/con

（未完待续）

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