为了解决以上科学问题，作者设计了如下的实验。首先，在研究水稻根系微生物组成的问题上，作者分别在温室和田间进行了水稻种植，通过高通量测序技术分析了根系不同部位，包括根际、根表、根内微生物的不同，由于实验中使用了不同的水稻品种、不同的土壤和地理环境及培养条件，因此也分析了影响根系微生物组成的关键因素，同时，在分析差异微生物的过程，考虑到水稻水田培养的特殊环境，导致产甲烷菌的富集造成大量甲烷气体的产出，对环境方面有重要影响的生态因素，作者也详细分析描述了本实验体系中产甲烷菌的情况。另一方面，为了研究根系微生物的定殖过程，作者采用了时间序列实验，即在水稻不同的生长时间取样检测根系不同部位微生物组的变化，由此揭示微生物从外到内逐渐变化的过程。

另一方面，本文中对高通量测序得到的数据采用了较多的分析方法，包括PCoA、CAP和PERMANOVA等，由于上次组会提到了PCA,我就先从主成分分析PCA说起，主要介绍一下这些方法的异同。PCA和PCoA都是利用了降维的思想，PCA是基于样品原始丰度数据，PCoA是样品间距离矩阵，也就是说，PCA体现的是原始数据，而PCoA是把原始数据转化为距离形式进行体现。由于PCoA是距离体现样品差异，常使用到的距离计算方法有Bray, unifrac,jaccard等。我们经常用到的是Bray，而本文中用的是unifrac。这些方法可依据自身实验搭配使用。解析高通量测序产生的海量的微生物群落数据，还需要借助约束排序（Constrainedordination）和有监督学习（Supervisedlearning）的统计分析方法，通过某种已知的样本间相互关系（比如某种样本分布/分组）或某种样本检测指标（连续型变量），尽可能地按照这种关系提取原始群落数据中与之相关的模式特征，而不关注其它无关的数据信息。使用CAP，我们可以不考虑其它因素，只把某单一因素的影响体现出来，分析方法与constrainedPCoA相同。另一方面，虽然通过PCoA肉眼能大概分辨分组是否可以清晰分开，但实际上，严谨的统计学还是需要检验的，说明这所谓的“清晰分开”到底显著不显著,这时候就要用到方差分析，分析样本间差异的程度，最常用的就是PERMANOVA,计算得到的P值大小可以判断差异的显著性。也就是说，通过PCoA和CAP分析我们可以得知影响样本的关键因素及影响程度，而通过PERMANOVA分析可以得知分组间是否具有显著差异，作者结合了这三者对数据进行了分析。

Endospherecommunities had the lowest α-diversity and the rhizospherehad the highest α-diversity.

TheOTUs enriched in the rhizosphere are very successful at colonizing theroot, as 119 out of the 152 OTUs enriched in the rhizosphere are also enriched in either the rhizoplane or endospherecommunities or both (Fig. 2B).

Nearly all of the OTUs depleted from the rhizosphereare also depleted in the rhizoplane and endosphere communities.

The rhizoplane shares 713 of the 1,961 OTUs that aresignificantlydepleted from the endosphere.

Pleomorphomonas (nitrogen fixation)               Fibrobacteresand Spirochaetes (cellulose degradation)

Unconstrained PCoA reveals nodistinct clustering of microbiomes of different ricecultivars.

Genotypic differences in rice have asignificant effect on rootassociatedmicrobial communities.

CAP analysis constrained to ricecultivar while conditioning on rhizocompartment,soil source, and technical factors reveals distinct clustering patterns of microbiomesbetween rice genotypes.

Thetwo japonica cultivars clustered together and the two O. glaberrimacultivars clustered together; however, the indicacultivars were split, with 93-11 clustering with the O. glaberrimacultivars and IR50 clustering with the japonica cultivars.

由此，作者在温室的条件下，分析了不同水稻品种在不同土壤中根系不同部位的微生物组，比较了它们的异同，发现了影响水稻根系微生物组成的关键因素，第一影响因素是根系部位，第二影响因素是土壤类型，而水稻基因型有一定的影响。因为温室条件毕竟与实际环境不同，为了验证以上结论，作者在不同地点的水田中也种植了水稻。

在这8个地点中存在着2种耕作方式，一种是我们经常说的有机农场，有机农场中是不采用化学用品（如农药、化肥等），不采用基因工程获得的生物及其产物，而另一种叫做ecofarming的生态农场与有机农场的不同点在于生态农场可以使用化学肥料、杀虫剂等，但也不能种植转基因品种同时不进行收割后的熏蒸。在不同的耕作方式下，水稻根系微生物也出现了明显差异，表明耕作方式会影响水稻根系微生物的组成，将两种耕作方式的样品在OTU水平下进行比较后发现，有机农场种植的水稻中富集了许多固氮菌，而生态农场水稻中富集了一些与甲烷循环相关的微生物。

甲烷是天然气、沼气的主要成分，属于温室气体的一种，对生态环境有较大的影响，而且稻田对大气中的甲烷含量贡献较大，这主要是由于水田的厌氧环境导致大量产甲烷菌的存在，水稻生长在这种特殊的环境下导致存在与其他陆生植物不同的产甲烷菌，所以作者进一步分析了根系各个部位不同产甲烷菌的丰度差异。由于水稻根部存在特殊的通气组织，所以一般认为根表及根内的氧气含量是高于根际环境的，所以大部分产甲烷菌的丰度在根际最多，但也个别菌例外。

同时，通过网络图寻找所有OTU之间的联系，作者只呈现了含有产甲烷菌的module，发现这些模块中包含的大部分菌都具有潜在的与甲烷循环相关的功能。

综上，作者分别在温室和大田条件下种植水稻，分析了水稻根系微生物的组成，找到了影响根系微生物变化的关键因素，包括不同根系部位、土壤类型、地理环境、耕作、基因型等因素，特别分析了稻田中特异存在的产甲烷菌，由此，从不同空间及角度为我们呈现了水稻根系微生物组是什么样的以及不同根系部位微生物的差异及联系。下一步，作者采用了时间序列试验来解决第二个重要的科学问题，微生物在根系定殖的过程。

作者在温室条件下种植了一种水稻品种，分别在0、1、2、3、5、8、13天时采集水稻样品，分析根系不同部位微生物的组成，并与42天采集的认为根系微生物组已处于稳定阶段的样品进行比较，A图中展示的为根内微生物的reads数，作者采用的是无菌苗移苗的方式，所以在0点时，未测出微生物（图中蓝色表示），24小时后，根内检测出了微生物，表明微生物以较快的时间24小时内进入到根内，而随着微生物的增加，在13天时，根内的微生物量已达到了42天时的量。通过PCoA比较土壤及各部分根系微生物发现，不同部位的微生物有明显差异，而将样品按取样时间着色后发现，根系微生物随着时间发生变化，而最后一个取样点的样品最接近于42天时的样品。表明根系微生物在13天时已达到稳定。比较不同时间点微生物在门水平上的变化发现，在水稻无菌苗移入土中24小时内就发生了较大变化，这与我们的实验结果是一致的。为了进一步研究不同根系部位微生物随时间的动态变化，作者将52个核心OTU的丰度利用折线图表示，描述了这些微生物随时间的变化过程，在土壤样品未发生较大变化的基础上，根际土中这些微生物的丰度从第一天开始逐渐上升，在第3天达到峰值，后期开始下降并逐渐趋于稳定无较大变化，而根表也随着时间的增加微生物丰度逐渐升高，在第8天达到峰值后逐渐下降的同时，根内的微生物在取样时间内一直在增加。以上的实验为微生物在根系的定殖过程提供了证据，土壤中的微生物先到达植物根际，经过根表再到达根内，而这个过程在24h内即发生，随着根际及根表微生物分别达到峰值再减少后，根内微生物处于上升状态，在14d左右达到稳定。

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