本文转载自“态昌基因”,已获授权

肠道微生物组分析做为早期肝癌的一种靶向无创标志物的工具

Gut microbiome analysis as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for early hepatocellular carcinoma.(Gut,IF:17.016)

一导读

肝癌的死亡率在所有癌症中排名第三。由于早期肝癌缺乏特异的症状和早期诊断标志物，大部分肝癌患者诊断时已是晚期，预后很差，死亡率高达95%。据统计，2015年中国新发现343700例男性病患，以及122300例女性病患，结果显示患者多由HBV(乙肝)病毒的传播和HBV诱导的肝硬化发展而来。

因此，亟需早期肝癌的新型诊断标志物和新型的治疗策略，以期改善预后。已知动物模型中，肠道微生物通过“肠肝轴”促使肝癌恶化，但人类患者的肠道微生物特征还未报道。肠道微生物作为特殊疾病的预测手段（包括了二型糖尿病、肝硬化和结直肠癌）已经取得了喜人的进展，人体肠道微生态与肝病密切相关，其作为肿瘤或特定疾病的无创诊断标志物具有潜在的可能性。

二摘要

本研究从中国的华东、华中和西北地区共收集486份人粪便样本，最终419个样本进行 Miseq测序。通过75例早期肝癌、40例代偿期肝硬化和75例健康人建立肝癌诊断模型；由56个健康、30个肝癌早期和45个肝癌晚期样本进行验证；最后通过新疆18个和郑州80个肝癌患者样本进一步验证诊断模型的可靠性。

早期肝癌患者与肝硬化患者相比，肠道微生物多样性上升，Actinobacteria门丰度上升，13个属（包括芽殖菌Gemmiger和副拟杆菌Parabacteroides)富集。肝硬化患者与健康志愿者相比，肠道微生物多样性降低，丁酸盐产生菌丰度下降，而脂多糖产生菌丰度上升。通过随机森林分类树与5倍的交叉验证找到了最优的30个生物标志物，在75个早期肝癌患者与105个非肝癌志愿者的模型中，模型准确率达到了80.64%。在早期肝癌患者与晚期肝癌患者间的验证实验中，30个生物标志物展现了惊人的潜能；值得一提的是，本研究是全球第一次临床大样本描述肝癌患者的肠道微生物特征，第一次报道了早期肝癌的肠道微生物标志物诊断模型的成功建立和跨区域验证。

三实验设计

四研究结果

1. 肝癌早期、肝硬化及健康人的菌群多样性比较

如A图所示，肝硬化病人与健康人相比，多样性下降；早期肝癌病人与肝硬化病人相比，多样性升高。比较健康、肝硬化和早期肝癌患者的菌群多样性（B-D图）,Shannon指数、Simpson指数和Invsimpson指数都显示肝硬化患者菌群多样性显著下降。

如图E所示，Venn图展示了三组间独有和共有的OTU，有90个OTU只存在于早期肝癌患者中。计算weighted UniFrac距离矩阵进行主成分分析（PCoA），来展示样本间的菌群结构的差异性。如图F所示，所有样本的微生物群落均匀分布。

2. 肝癌早期、肝硬化及健康人菌群组成比较

在门水平，三组中Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria门平均占比达90%，为三种主要优势菌（如图AB所示）。

与肝硬化患者相比，早期肝癌患者菌群中Actinobacteria 门显著升高（如图C）相对应的，包括Gemmiger,Parabacteroides和Paraprevotella等共13个属显著富集（如图D）。

与健康人相比，早期肝癌患者菌群中Verrucomicrobia门显著下降(如图E),在属水平Ruminococcus , Phascolarctobacterium 和 Alistipes等共12个属显著下降(如图F),而Klebsiella和Haemophilus 等6个属显著升高(如图G)。

3. 寻找生物标志物

通过75例早期肝癌和105例非肝癌（40个肝硬化和75个健康）志愿者的菌群，构建随机森林模型进行5倍交叉验证，得出30个OTU为最优数据集（如图A）。通过研究阶段的菌群数据与30个OTU生物标志物来计算POD指数，作ROC曲线分析，得到AUC为80.64%（如图B）。与非肝癌患者相比，肝癌患者的POD值显著升高。这些数据表明，基于OTU标记物的POD值在诊断早期肝癌与非肝癌的诊断潜力巨大。

4. 模型验证及独立性验证

在验证阶段，56例健康、30例早期肝癌和45例晚期肝癌志愿者的数据用来验证POD值的诊断功效。30例早期肝癌与56例健康志愿者相比，POD值显著升高，AUC值为76.80%(如图B)，说明POD值在早期肝癌的诊断中效果显著。为了验证POD值的特异性，比较了56例早期肝癌与45例晚期肝癌的POD值，结果显示晚期肝癌患者的POD值显著升高，AUC值为80.40%(如图C)，说明POD值在晚期肝癌的诊断中效果也十分显著。

除此之外，为了进一步验证POD值的潜力以及适用范围，18例新疆肝癌和80例郑州肝癌患者来进行独立验证。18例新疆、80例郑州肝癌患者与56例健康志愿者相比，POD值显著地高；18例新疆肝癌患者与56例健康志愿者构建ROC曲线，AUC值为79.20%（如图D)；80例郑州肝癌患者与56例健康志愿者构建ROC曲线，AUC值为81.70%（如图E）。这些结果表明，POD值对不同地域的肝癌诊断具有强大的诊断效果。

参考文献：

Ren Z, Li A, Jiang J, et al. Gut microbiome analysis as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for early hepatocellular carcinoma[J]. Gut, 2018: gutjnl-2017-315084.

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