文章标题：Barcoded microbial system for high-resolution object provenance

发表期刊：Science

发表时间：2020.6

第一作者：Qian Jason；Zhi-xiang Lu；Christopher P. Mancuso；Han-Ying Jhuang；Rocío del Carmen Barajas-Ornelas；Sarah A. Boswell

第一单位：Harvard Medical School, USA

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.aba5584

编译：李婷 云南大学国际河流与生态安全研究院

摘要

确定物体源于何处是人类健康、商业和食品安全的一个重大挑战。位置特异性微生物提供了一种经济且灵敏的方法来确定物体的来源。本研究创建了一个合成的、可扩展的微生物孢子系统，该系统可在1小时内以米级分辨率和接近单孢子的灵敏度识别出物体的来源，且可以安全地引入环境，并从环境中回收。该系统解决了物体起源中的关键问题：环境持久性、可扩展性、快速简便的解码和生物保护。该系统与SHERLOCK（一种Cas13a RNA引导的核酸检测方法）兼容，可实现广泛应用。

引言

供应链的整体化使确定农产品和成品的来源更加复杂。在食源性疾病的防控方面，确定物体的来源可能十分重要，但目前的标签技术过于费力且准确度较低。标记经过该地点的人或物的工具可作为指纹识别和视频监视的补充，有利于执法部门的工作。微生物群落为标记方法提供了一种潜在的替代方法。任何物体都可吸收环境中自然存在的微生物，因此可利用物体的微生物组成来确定其来源。但这种方法面临的挑战在于随时间变化的微生物群落多度，不同地点之间微生物组成的相似性，以及自然环境图谱测试的广泛性、昂贵性和耗时性。

为克服这些挑战，建议引进和使用合成的、不易存活的微生物孢子，这些孢子带有条形码，能够唯一识别感兴趣的位置（例如，食品生产区）。这些合成孢子可以提供一种灵敏、廉价和安全的方法来追踪物体来源，但前提是要满足几个标：1）微生物必须与工业规模的生长模式相适应；2）合成孢子必须含生物成分，在野外不能存活，以免对生态造成不利影响；3）合成孢子必须在环境中存在并能标记通过它的物体；4）物体来源信息的编码和解码必须快速、敏感且特异。类似的条形码方法也曾用于模拟病原体的传播，但没有明确解决这些问题。本文叙述了条形码微生物孢子（BMS）系统，这是一个可扩展、安全和敏感的系统，可使用DNA-BMS混合物来确定物体的来源（图1A）。

BMS技术的原理

BMS系统利用孢子在环境中长期存在而不会生长的自然能力。设计了非冗余的DNA条形码，将其整合到枯草芽孢杆菌和酿酒酵母孢子的基因组中，创建了一组BMS，可以组合使用以提供无限的识别码。BMS可以使用标准克隆和培养技术大规模生产，通过喷洒接种到表面，并转移到与接种表面接触的物体上。为了识别条形码，从物体中取样的BMS可以通过一系列方法进行分析和解码，包括SHERLOCK、重组酶聚合酶扩增（RPA）法、基于Cas13a的核酸检测分析、定量聚合酶链反应（qPCR）和测序（图1A和图S1A）。

图1. 条形码微生物孢子系统检测的高特异性和灵敏性。

BMS的应用不会影响本地环境

首先，使用需要补充氨基酸才能生长的营养缺陷型菌株。第二，保证细胞萌发不足。对于枯草芽孢杆菌孢子，我们敲除了编码萌发受体的基因和编码细胞壁裂解酶的基因。从该突变菌株产生的10¹²孢子表明，它们无法形成菌落或在丰富的培养基中生长，并且在室温下，可在 3个月内保持稳定且不发芽（图S2，A和C）。对于酿酒酵母，在使用前加热30 min，以杀死营养细胞和孢子。在丰富的培养基上培养超过10⁸个煮沸的孢子不会产生菌落（图S2、B和D到F）。用于产生BMS的抗生素耐药盒通过位点特异性重组移除，以防止耐药基因水平转移到其它生物。最后，插入的条形码不编码任何基因，如果发生水平转移，则不应赋予任何适合性优势。追踪土壤样本的微生物组分，发现与随时间的自然变化或对水分的响应相比，BMS接种对微生物组的影响并不显著。

可同时应用多个BMS并进行解码

我们设计了一系列串联的DNA条形码，可存在10⁹个单个条形码甚至更多，每一个的条形码的Hamming距离都大于5。为了测试条形码设计的特异性，构建了22个条码及其匹配的CRISPR-RNAs（crRNAs），并使用SHERLOCK体外检测了所有的排列。22个crRNAs都清楚地区分了正确的条形码目标（图1B）。为了扩大系统规模，我们设计了一种快速、简便的方法来同时筛选大量的条形码和crRNAs，以消除具有交叉反应或背景的条形码和crRNAs。我们在体外验证并执行了n-1条码RPA反应，并用相应的crRNA和水RPA对照物测试了94对crRNA条码，排除了17对背景值高的和7对交叉反应的crRNA条码（图S1、B和C）。为了检测体内的敏感性和特异性，我们将57个条形码整合到枯草杆菌中，11个整合到酿酒酵母中。利用加热和氢氧化钠开发了一种有效的孢子裂解方案（图S4），从而能够利用SHERLOCK（图1C）实现接近单孢子分辨率的检测。crRNA条码对的体内和体外特异性筛选结果相似（图S1、C和D）。此外，条形码采用了特定序列和共享组序列的串联设计（图S1A），以帮助在只有部分样本包含感兴趣的BMS的情况下进行高通量检测。该组序列与野外可部署检测兼容，可用于确定感兴趣的BMS是否存在，然后再进行第二次分析以明确识别BMS（图1D）。这两步过程解决了现场可部署探测的吞吐量限制，并降低了测序成本。

BMS系统可在多种模拟真实环境中工作

在约1到2平方米的实验中（图S5A和表S6），使用qPCR从表面样品或表面拭子中检测和定量BMS。我们发现在沙子、土壤、地毯和木材表面上，BMS可存在3个月，且随着时间的流逝没有损失（图2A）。值得注意的是，多次扰动测试（例如，模拟风、雨、吸尘或清扫）并没有降低从地表检测BMS的能力。其次，我们建造了一个约100平方米的室内沙坑（图2B），在一定区域内接种BMS（图2C），并且能够在3个月内使用SHERLOCK检测BMS（图2D和图6D）。扰动没有引起对未接种区域的明显传播（图2D）；即使是一个风扇掉入沙土的灾难性扰动，也只能使BMS扩展数米（图S6）。在室外环境中，接种在草地上的BMS在暴露于自然天气5个月后仍然可以检测到，并且在接种区域之外的扩散极小（图2E）。这与其它芽孢杆菌报告的低水平再雾化一致。

图2. 条形码微生物孢子系统的持久性、扩散性和稳定性。

BMS可以灵敏地转移至受试环境对象上

在1平方米规模的测试中，只需将BMS放在接种表面上几秒钟即可将BMS转移到橡胶或木制物体上，从而产生高达约每毫升100孢子的反应输入量。在100 m²范围内，BMS可以转移到接种沙坑内的鞋上（图2F）。此外，在非接触表面上行走数小时后，仍可以检测到转移到鞋子上的BMS，根据qPCR定量，当行走2小时时，BMS计数减少了两倍（图2G）。我们用经过BMS接种区域的鞋在未接种的表面上行走后，无法检测到孢子。因此可得出结论，BMS可在环境中持续存在且不发生明显的扩散，可以转移到经过环境的物体上并保留，并且可以使用SHERLOCK敏感而特异的检测到。BMS系统可用于标记特定的位置，以确定是否有人或物体经过该位置。我们将不同的表面划分成网格；给每个网格区域接种一个、两个或四个非冗余BMS（图3A）；并用不同的测试对象（例如鞋子）接触它们。为了模拟野外环境，我们使用便携式光源、丙烯酸滤光片和移动电话摄像头对SHERLOCK读数进行成像（图3A），并确定物体来源（图3、B和C）。样品采集后1小时内即可在野外确定种源。为了评估系统对确定物体来源的敏感性和特异性，我们考虑了不同的分类标准，每个区域的BMS数量也不同。在接种4个BMS的区域中，假阳性率为0.6%（1/154），假阴性率为0%（0/62）。每个区域仅接种一个或两个BMS就可确定物体来源，尽管错误率较高（图3D）。可在四种测试表面类型（沙、土壤、地毯和木材）上确定来源。但在实际环境中需要进一步验证以确定错误率。该实验表明，BMS可在米尺度分辨率下确定物体来源，而这是利用自然微生物群落特征很难实现的。

图3：使用条形码微生物孢子系统和现场部署检测来确定对象来源。

BMS系统可高效地追踪食物来源

食源性疾病是一个全球性的健康问题，迫切需要确定食品污染源的快速方法。由于现代市场链的复杂化，目前的方法耗时较长，而且成本高昂。接种了枯草杆菌BMS的植物能够将实验室培育的叶状植物映射回生长的特定盆栽中（图4、A和B）。从第一组叶子出现后一周开始，接种BMS4次，匹配苏云金芽孢杆菌（Bt）孢子接种方案。最后一次接种BMS一周后，从每个盆栽中收集一片叶子和一个土壤样本，用SHERLOCK进行测试。除两株接受变异组条码序列的植物外，其余均为阳性，表现出检测的特异性（图4B）。通过Sanger测序，确定了18个BMS植株生长的花盆。从DNA提取到序列识别所需时间不超过24小时。若通过大规模并行化的杂交检测，可将这一时间缩短为数小时。

BMS接种植物的交叉关联并不影响种源的确定

为了模拟食品加工过程中可能发生的交叉关联，将接种了特定BMS的叶片混合。与接种的其他表面不同，与植物接种的BMS不容易转移到与该植物接触的物体上。尽管在叶片之间存在一定的转移，但仍可通过Sanger测序确定每片叶子的起源。（图4，C至E）

图4. 条形码微生物孢子系统确定产品来源。

Bt可以用来确定食物的来源

在农业生产中用Bt孢子作为替代物来测试BMS是否能在现实的食物供应链中持续存在。对于已知Bt接种状态的植株，我们正确识别了所有Bt阳性和阴性植株（共38株）。此外，在商店购买的24个产品中，有 10个产品检测到了Bt。出乎意料的是，即使在清洗、煮沸、油炸和微波加热之后，BMS和Bt孢子仍可以检测到，突出了从熟食中确定来源的潜力。这些结果显示了利用BMS系统确定产品来源的潜力。

结论

本工作展示了如何以高通量的方式制造合理的微生物芽孢，为物源问题提供新的解决方案。本研究已证明：1）BMS在环境中持续存在；2）不会扩散到接种区外；3）从土壤、沙子、木材和地毯转移到接触物体上；4）允许使用实验室和现场部署的方法灵敏和快速读出。在现实环境中快速标记对象并确定其来源的能力有着广泛的应用。数据表明：BMS可以在各种环境中工作，但需要进一步验证。BMS系统的未来迭代可以设计为有限的传播，并控制在高流量地区使用。该系统还可以提供有关位置历史记录的时间解析信息，使其应用范围更广。

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