生物膜反应器抗性组对替加环素浓度升高的动态响应

逐步提升的替加环素压力下好氧生物膜微生物群落耐药性发展特征

Developmental dynamics of antibiotic resistome in aerobic biofilm microbiota treating wastewater under stepwise increasing tigecycline concentrations

Environment International 2019

https://doi.org/10.1016/j.envint.2019.105008

第一作者：田哲¹²³

通讯作者：杨敏^123*、张昱^123*

其他作者：刘如铟³、张红¹

作者单位：

¹环境水质学国家重点实验室，中国科学院生态环境研究中心

²工业废水处理国家工程实验室，中国科学院生态环境研究中心

³中国科学院大学

摘要

这项研究旨在揭示替加环素（第三代四环素）对环境微生物群抗生素抗性发展的影响。我们构建了两个含有好氧生物膜微生物群落的生物接触氧化反应器，其中一个在24小时水力停留时间下持续投加合成废水，且该合成废水中的替加环素浓度逐步增加（0到25mg/L）。在636天的实验周期中，对照反应器和替加环素暴露反应器中化学需氧量（COD）去除率均超过90%，且均实现了完全硝化。替加环素暴露系统出水中替加环素浓度始终＜0.051mg/L。利用宏基因组测序和传统的分离培养方法，发现只有当进水替加环素浓度达到10mg/L和25mg/L时生物膜微生物群落的抗性组丰度和耐药菌比例才分别显著升高（p<0.05）。替加环素系统抗生素抗性的增加主要是由于四环素降解基因tetX的富集所致。部分典范对应分析表明，群落耐药性变化的主要驱动力是细菌群落的演替（垂直途径）。网络分析和基因组拼装分析进一步表明，携带tetX的黄质杆菌（Flavobacterium）的增殖降低了好氧生物膜微生物群落实际暴露的抗生素浓度，进而使得在高替加环素投加浓度下群落表现出较低水平的耐药性发展。这项工作为管理和评估这种新型抗生素引起的耐药性风险提供了科学依据。

背景

替加环素是第三代四环素，主要应用于临床多重耐药病原菌导致的感染治疗。替加环素经静脉注射后超过90%的母体物质会通过尿液或粪便排入环境，最终进入污水生物处理系统，而目前关于替加环素诱导耐药性产生的研究主要关注临床病原菌，尚没有研究考察替加环素压力下环境微生物群落耐药性的发展情况。

主要结果

01 好氧生物膜反应器的运行

根据抗生素投加浓度，将636天的实验周期分为TG0、TG0.1、TG1、TG5、TG10、TG25等6个阶段，相对应的对照系统的6个阶段记为C0到C25。两个反应器在COD和氨氮去除上表现稳定。替加环素投量为25mg/L时出水的抗生素浓度为0.0509 ± 0.0038mg/L（表S2），表明大多数替加环素被好氧生物膜反应器的微生物群去除。

表S2 反应器出水的替加环素浓度。

02 抗生素抗性的发展

替加环素投量为10mg/L时，宏基因组测序检测到抗性组丰度显著升高（p<0.01）（图1a）；替加环素暴露系统中，tetA、tetC、tetG、和tetX等四环素抗性基因占主导（图1b）。TetC是初始阶段最主要的tet基因，其丰度随替加环素投量的增加从4.04×10⁻³±5.61×10⁻⁴（TG0）逐渐降低到1.70×10⁻³±1.56×10⁻⁴（TG25）。TetX是TG0阶段排名第二的tet基因，其丰度在5mg/L的替加环素投量下就显著增加(p<0.01)，并成为最后阶段最主要的tet基因（3.67×10⁻²±4.66×10⁻⁴）。在TG25阶段，tetA也随着替加环素投量的增加而富集，成为TG25阶段排名第二的tet基因。实验周期内tetG丰度在2.44×10⁻³±7.53×10⁻⁴范围内波动。此外，对照系统中四个tet基因在实验期间呈现下降趋势（图1b）。四种tet基因的变化情况进一步使用qPCR进行了验证。

图1 宏基因组测序显示不同好氧生物膜样品中抗性组(a)和四环素抗性基因(b)的平均丰度变化。*：p < 0.01。

03 细菌群落的演替

基于Miseq测序分析了好氧生物膜细菌群落的演替过程。替加环素暴露系统的细菌群落结构发生了很大变化，但是始终保持较高的多样性（Shannon index, 3.74 ± 0.32）。14个细菌属在替加环素投量增加过程中被富集，例如，Flavobacterium、Runella和Flexibacter在替加环素投量增加到5mg/L时丰度显著增加（p<0.01）（图2）。

图2 替加环素系统不同好氧生物样品中14个富集菌属的丰度变化。

04 水平和垂直基因转移对抗性组变化的贡献

部分典范对应分析（pCCA）发现细菌群落演替（垂直途径）和水平转移元件改变（水平途径）分别解释了对照系统中抗性组变化的16.13%和7.97%，而这一结果在替加环素暴露系统中分别是19.87%和5.58%。这表明垂直转移是两个系统中抗性组变化的主要驱动力。

网络分析揭示了替加环素压力下ARGs的潜在宿主（图3），发现tetX基因的潜在宿主主要是Flavobacterium、Methylotenera、Cytophaga、Leadbetterella、Phenylobacterium、Pedomicrobium、Methylobacterium和Flexibacter。进一步使用宏基因组测序的基因组组装方法确认tetX基因的宿主，发现tetX由Chitinophagaga、Cytophaga、Flavobacterium和Leadbetterrella携带，它们均属于Cytopha-Flavobacters集群。同时，tetX在Chitinophaga、Flavobacterium和Leadbetterrella中与ant6ia共线，在Leadbetterrella和Chitinophaga中与acrB、整合酶或转座酶基因共线（图4）。

图3 网络分析显示替加环素系统中ARGs和细菌属之间的共发生关系。

图4 基因组拼装揭示tetX在其潜在宿主细菌中的遗传环境。

结论

本研究建立抗生素好氧生物膜连续暴露系统，发现替加环素在10mg/L的剂量下才会导致耐药基因丰度的显著增加(p< 0.01)。替加环素主要诱导一种四环素降解基因tetX的富集，该基因同样可降解替加环素导致其失活，具有“利他性”。网络分析和基因组拼装分析进一步表明黄质杆菌是好氧生物膜中tetX基因的主要宿主，其可通过降低抗生素的浓度导致群落水平上相对较低的抗性发展。

中国科学院生态环境研究中心

环境水质学国家重点实验室

环境微生物技术研究组 发布

作者：田哲

编辑：韩子铭

审核：张昱

猜你喜欢

10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature Cell专刊 肠道指挥大脑

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组

专业技能：学术图表 高分文章 生信宝典 不可或缺的人

一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树

必备技能：提问 搜索  Endnote

文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical

扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图

16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun

在线工具：16S预测培养基 生信绘图

科研经验：云笔记  云协作 公众号

编程模板: Shell  R Perl

生物科普:  肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。PI请明示身份，另有海内外微生物相关PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

↓ 点击“阅读全文”获取全文链接