“鸟枪换炮”，nanopore测序在宏基因组中的应用

2003年使用一代测序破译sars病毒用了4个月，2020年初使用二代测序破译新冠病毒用了4天，现在使用使用nanompore纳米孔测序只需7个小时。技术一直在快速进步，是时候“鸟枪”换炮了。

基于鸟枪法（Shotgun Sequencing）的高通量测序已经走过10多年，在宏基因组领域的应用也超过10年，在这10多年里，基于二代测序高通量的特性，在宏基因组，16S测序中已经取得了非常大的进展。然而，二代测序读长短、建库周期长、无法实时测序等技术特点，依然限制了宏基因组数据分析。尤其是读长短，只有不到2X300bp，比对唯一性差，会造成一对多的比对，并且短读长无法得到好的拼接效果，无法直接从宏基因组中拼接出完整细菌基因组。而这些技术缺点，通过新一代的纳米孔测序可以很好的解决。下面我们来总结一下nanopore测序技术在宏基因组中的应用。

1、在采样点直接测序分析

在采样点直接进行测序，能够消除取样和样品分析中可能存在的许多障碍，包括减少微生物存储，运输过程中发生的降解，最快得到分析结果。但是统测序平台通常笨重、易碎、不易装运，需要稳定的实验室条件，例如恒温恒湿，而且需要大量的电力基础设施。再加上普遍缺乏设施和经培训的合格人员，使得这些技术难以部署在偏远地区或移动环境中。而纳米孔测序的便携性，而纳米孔测序MinION重量不足100g，不到一台iPhone手机的重量，MinION利用笔记本电脑上的USB接口通电，对DNA或RNA进行测序，是一种适用于实地研究的独一无二的便携式设备。而最新推出的以及MinION Mk1C，集成计算模块，更加方便。纳米孔测序可实现数据流的实时传送，支持即时分析。可以最快时间得到结果。

2、病原微生物快速鉴定

对于病原微生物鉴定来说，快速得到鉴定结果至关重要。例如在监测疾病爆发或在危及生命的感染性疾病中鉴定病原微生物都需要快速获得准确的基因组信息。

在病毒爆发期间，前瞻性的基因组数据有助于提供该病毒与其他病毒的亲缘关系、进化模式、地理分布和人类宿主等相关信息。这些信息可用于协助流行病学调查，尤其是在结合使用其他类型的数据（例如病例数量）时。更快速的获取并共享数据，将有助于更好的响应公共卫生挑战。而快速获得病原体序列数据同样能够支持开发疫苗和提升诊断能力。

利用纳米孔便携，快速建库，实时测序等特点，可以最快时间得到鉴定结果。纳米孔测序是目前病原微生物鉴定最快速高通量测序平台。纳米孔测序目前已经应用在埃博拉病毒，寨卡病毒、黄热病毒和麻疹病毒等多次疫情中。在2019年爆发的新冠病毒疫情中，纳米孔测序同样发挥了重要作用。使用纳米孔测序仪，利用纳米孔测序的ArticNetwork工作流程，从拿到样品，只需7小时即可得到新冠病毒全基因组序列。

3、耐药基因识别

在研究环境下，对病原体样品进行快速抗微生物药物耐药性表征使得研究者能更好地了解耐药性及进化情况。在临床环境中，包括世界卫生组织 (WHO) 在内的多家机构及相关报告均提倡进行快速诊断以表征抗微生物药物耐药性，从而帮助选择恰当治疗方式，避免出现开药过多或使用无效抗菌药物。

纳米孔超长读长在解决复杂的重复基因座结构方面具有显著优势。与采用细胞培养的方法相比，纳米孔测序还是一种更快速的抗微生物药物耐药性分析方法。结核分枝杆菌TB感染的抗微生物药物耐药性表征。使用培养法，往往需数周时间完成。而使用纳米孔测序法可将患者BCG鉴定、吡嗪酰胺耐药性检测及系统发生定位的总时间缩短至7.5小时以内，同时5小时后即可获得完整的敏感性结果。，

4、长读长具有更高的准确性

传统的短读长测序长度通常在200-300bp，双端测序也只能达到16S序列长度的1/3。由于微生物之间的同源性，经常会出现同一片段比对到多个物种的情况，无法精确鉴定到具体的物种。而纳米孔测序长度最大可达到2M以上，N50可以达到25K。长度越长，比对唯一性越好，可以很好比对到唯一物种。甚至可以对整个核糖体操纵子进行测序（16S序列+23S序列等），精确进行物种鉴定。

5、基因组中拼接细菌完成图

目前，利用纳米孔长读长可以很好的跨越基因组上的重复序列，可以很容易的完成细菌全基因组的拼接,直接得到完整染色体。同理，在足够高测序深度以及超长读长（utral long）的条件下，在纳米孔宏基因组测序中，也可以得到拼接得到细菌基因组完成图。这是一项划时代的技术。无需培养，直接测序得到细菌完成图。这极大的丰富了细菌基因组的数据库，后面将得有越来越多的细菌全基因组序列通过该方法得到。

参考文献：《纳米孔测序在微生物组研究中的优势》白皮书

https://nanoporetech.com/resource-centre/microbiomes-white-paper
作者：努力呗还能咋样呐
https://www.bilibili.com/read/cv7151303/
出处： bilibili