PNAS-2018-玉米根际的大规模田间重复研究确定可遗传的微生物

本文“植物微生物组”公众号原创，ID: plantmicrobiome

作者：张娜

原文链接：PNAS-2018-玉米根际的大规模田间重复研究确定可遗传的微生物

大家上午好，占用大家30分钟的时间，跟大家分享一下这篇文章。这篇文章的题目是：玉米根际的大规模田间重复研究确定可遗传的微生物

首先介绍一下本篇文章的通讯作者：

Ruth E. Ley：在马克斯—普朗克发育生物学研究所，康奈尔大学，主要研究人类和微生物组的共进化，文章：动物和植物与微生物的关系都做

Jeff Dangl：在北卡罗来纳大学，主要研究植物和微生物的互作

Rob Knight：加州大学，他的实验室已经开发出许多软件工具和实验室技术，可以实现高通量微生物组科学，他对本篇文章的数据处理给予了极大的贡献。

在2013年04月，他们曾合作在PNAS中发表了一篇有关玉米根系微生物组的文章。当时那篇文章的科学问题是探究遗传变异对微生物组的影响。使用27个玉米品系的500个样品。发现不同玉米品系的根系细菌微生物组有明显的遗传变异，即微生物的多样性与植物的基因型相关。

那么基于13年的这篇文章，今年6月份，他们又在PNAS上发表了第二篇玉米根系微生物组的文章。文章中作者对玉米根系微生物组进行了多年，多点，大规模的研究，收集了近5,000个样品，从500到5,000的扩展对样品处理具有挑战性，生物信息学分析也非常具有挑战性，因为有超过5亿个16S序列，最终作者确定了143种可遗传的微生物。

此外，该团队还确定了一个核心根际微生物组，并且研究了植物年龄、种植地和天气等条件对微生物组的影响。

我们都知道植物根部富集了大量的微生物，并且基于作者13年发表的文章和之前很多文章报道过的：已知植物基因会影响根际微生物组。那么是所有的微生物都会被植物基因影响呢？还是只是部分微生物？到底哪些微生物是受植物基因调控影响的呢？作者想确定一下这些可遗传的微生物。也就是本篇文章的科学问题：鉴定出这些可遗传的微生物。

作者选取大规模重复性的田间样品研究来确定可遗传的微生物，原因有3个：

1、之前研究大多数是在温室或者实验室进行的，其中环境受到一定的限制。

2、少的样品量，缺少时间和空间上的重复也容易造成一些错误的结果。

3、即便小规模研究可以评估植物基因型对微生物组的的影响，但是它们缺乏量化植物基因型对特定分类群影响的能力。

因此，大规模重复性的田间样品研究对于确定可遗传的特定分类群是必须的。

对于农作物的选择，作者选取了玉米,选择玉米的理由：

1、重要的粮食作物

2、丰富的表型多样性（表型受基因影响，基因很有可能影响根际微生物）

3、不同玉米品系之间，根的结构不同，对根际微生物有不同的影响

4、丰富的种质资源库。用于研究遗传复杂性状的最大公共玉米种质资源库（NAM品系）可以组成5000左右的重组近交系

我总结了一下作者的设计思路：我认为这篇文章可以分为两部分，第一部分微生物的组成，主要确定了玉米核心微生物组。第二部分影响根系微生物组的因素，因素分为环境因素和宿主自身因素，在宿主自身因素中作者又分析了宿主的年龄，基因型对微生物组的影响。

文章中用到的方法：作者在2010年和2015年分别在美国的3个州中的5个地点种植了玉米，期间同时对玉米进行了time-course的取样，最终2010年收集了4866个样品，2015收集了45个样品。收集后对样品进行了DNA 的提取，16S rRNA gene V4区域的扩增，测序以及数据分析。在这里明确一点：文中提到的根际微生物是指玉米根际以及根表富集的细菌和古菌。
在Illumina时代，由于平台测序长度的限制，V4单区测序（515F/806R）被更为广泛地使用，传统的V4区引物，由Caporaso等科学家(2012)设计，对细菌的覆盖度高，也可以同时检测到部分古菌。

那么，我们首先来看一下核心微生物组

作者首先确定了选择核心微生物组的标准：所有根际微生物样品中共有的OUT。按照这个标准，选出了7种核心菌，都属于变形菌门，其中3种α变形菌纲，两个β变形菌纲，两个γ变形菌纲。这7种核心菌在每一个样品中都有，暗示了这些菌在农业土壤中也是持久并且普遍存在的。如果将标准降低到95%的样品都有的，则有251个核心OTUs

下一步开始关注气候影响

作者对根际微生物组和天气（包括温度、降雨当天、降雨两天和降雨三天）进行了T检验，发现对于给定的相同天气条件，古菌和细菌的家族往往产生相同的变化样式,比如都表现出对温度呈现出正相关或者都表现出负相关的现象。同时对2010年和2015年数据的比较，发现，两年中有一些菌对天气的响应pattern也是一致的。

接下来我们来看一下种植地和宿主的年龄对微生物组的影响，作者将两个因素放到了一起进行阐述，可能是想对比来看。

为了鉴定年龄和种植地对根际微生物组的影响，作者展示了样品的β-diversity,其中距离选择的是用UniFrac距离的
unweighted UniFrac ，weighted UniFrac 两种方式均进行了绘图。

首先看A图，根际微生物组与年龄之间有一个很强的Pattern。B图，根际微生物组与Filed之间有一个很强的Pattern
当我们用weighted UniFrac 方式计算时（图C\D），发现年龄的Pattern是比Filed的Pattern更强的。

Bray-Curtis：将不同的 OTU 视为完全没有联系的单位，既关注丰度，也关注有无，但不考虑进化关系；

UniFrac：利用测序序列信息建立的物种系统发育树，考虑了物种的相似度。基于进化的距离。

主坐标轴分析—Principal coordinate analyses (PCoA)：可呈现研究数据相似性或差异性的可视化坐标，是一种非约束性的数据降维分析方法，可用来研究样本群落组成的相似性或相异性。它与PCA类似，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样本点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。两者的区别为PCA是基于样本欧式距离来寻找主成分，而PCoA是基于更多种距离矩阵（常用5种距离：bray_curtis, unifrac，euclidean, jaccard, manhatten）来寻找主坐标。

作者运用Adonis testing ，对植物年龄，种植地，植物遗传因素，这三部分对根际微生物组的影响力进行了量化，发现年龄是影响根际微生物组最大的因素，然后是种植地，最后是植物遗传因素。

为了进一步评估field、age、genotype和他们之间的相互作用对这种pattern的影响，作者对pcoa中的前10 个主坐标轴进行了分解。如图A，纵坐标是解释率，横坐标是10个坐标轴PC1-PC10。左图（A，C）显示由每个因子解释的方差分数以及由主坐标解释的总方差，而右图（B，D）显示归一化为1的比例值。

A图：PC1中贡献最大的是age，第二大的是age,地点和genotype之间的相互作用，PC2中贡献最大的是地点。对主坐标轴的分解暗示着植物基因和环境的相互作用对根际微生物的影响，同时说明在不同的植物年龄和种植地的条件下，基因对微生物组的影响是不同的。

对玉米的time-course实验研究中，在图中，可以清晰地看到每周微生物组的变化情况。作者发现假单胞菌在根际中的含量在第8周开始大幅度爆发增长，但是在Bulk soil中并没有明显变化，由此说明假单胞菌的暴发性增长很可能是由于植物调控造成的。而且在先前的研究中也有报道玉米根系微生物组中假单胞菌占主导地位。

8周之后，对样品中3种其主导作用的Pseudomonas进行Bray– Curtis 主坐标轴分析（如上图），颜色代表不同时间和地点下材料。显示Pseudomonas 的群体结构在不同的种植地之间是不同的，并且随着时间的变化Pseudomonas 的群体结构是稳定的(我没看出来)？因此，每一块种植地都具有Pseudomonas其特定的群体结构。（结论不强，组内数据量少：没有最初不同的种植地的Pseudomonas群体结构作为对照）

接下来，看一下基因型对根际微生物组的影响。

作者想看一下任何两个样品之间的基因型距离能否预测其根系微生物组的差异，看一下两个距离之间是否有什么关联。作者运用TASSEL方法绘制玉米基因型之间的距离，用UniFrac 距离表示其根系微生物组之间的距离。

结论是两个距离的关联是微弱的并且unweighted 和 weighted的结论是相反的，说明玉米品系总体的基因型差异并不能预测其根系微生物组的差异，例如：遗传距离最远的两个玉米品系，并不具有其相应根际微生物组之间最大的UniFrac距离。作者猜测原因：植物基因对微生物组的影响可能表现在特定的分类群上。

接下来看一下基因型对微生物组的丰富度Richness和特定分类群的丰度的影响

为了鉴定响应植物基因型的微生物分类群，作者比较了不同玉米中OTU的丰度差异。将玉米一共分成了6大类群，发现了有83组存在有丰度差异，涉及48个OTUs。其中也发现了一些有趣的现象，比如和其他组相比，sweet-corn group 富集了一些与氮固定活动相关的细菌（慢性根瘤菌、伯克氏菌，根瘤菌，草酸杆菌），原因可能是由于sweet-corn group 品系具有一个基因上的突变，使得在胚乳中蔗糖和葡糖糖的浓度增多，淀粉含量减少，进而使可供微生物利用的根系分泌物发生了改变引起的。

对27个玉米品系根系微生物进行差异比较，有255组有差异丰度的情况，涉及92个OTUs.
猜测原因：不同的玉米品系会影响根部分泌物，进而影响根际微生物组。例如：玉米品系Oh43，这些菌的丰度增多，原因很可能是根系统中缺少用于蔗糖吸收的转化酶。此外作者发现，部分相同的玉米品系之间对同种菌有相似的Pattern，这可能暗示着这些OTU行使相似的功能。

作者用了3种计算Alpha_Diversity的方法，对玉米组和玉米品系进行了物种丰富度的计算。发现：mixed 玉米组的微生物diversity是最小的，mixed中的Mo18W 品系又比其他玉米品系的diversity少。
(A) Shannon index：包括样品的OTU种类(richness)及均匀度(evenness)信息；
(B) Richness index（Observed OTUs）：只包括样品OTU种类信息；
(C) Chao1 index：基于样品测序中单拷贝OTU(饱合情况)估算样品物种种类的方法；chao1是度量物种丰富度的指标，它和丰度、均匀度无关，但是它对稀有的物种很敏感。
(D) simpson index：包括样品的可操作分类单元OTU种类(richness)及均匀度(evenness)信息，如在加拿大北部森林中，随机采取两株树标本，属同一个种的概率就很高。相反，如在热带雨林随机取样，两株树同一种的概率很低，他从这个想法出发得出多样性指数。用公式表示为：辛普森多样性指数=随机取样的两个个体属于不同种的概率。
(E) PD whole tree：考虑物种进化关系权重，认为分类学上非常近的物种存在一定相关性，甚至认为为一种；
例子：Alpha箱线图 Boxplot

最后，来看一下文章中很重要的一点：可遗传的OTU

首先，明确一下遗传力的概念。遗传力是在育种和遗传领域中使用的统计量，用于估计由于群体中个体之间的遗传变异导致的表型性状的变异程度。
简单说来，我们都知道：植物的表型是由基因型和环境共同影响的；同样，其表型变异 -Var（P）也是由基因和环境的共同变化决定的，因此广义的遗传力被赋予了这样的公式；即特定的群体在特定的环境下，由基因型造成的变异占此环境下总的表型变异的程度。

作者确定了143个OTUs，其遗传性显著高于预期。这143个OTUs的遗传力范围在0.15到0.25之间，相比于开花时间的0.9和其他传统的农艺性状而言，是比较低，很可能是环境因素的影响。尽管如此，植物基因对特定分类群还是有显著影响的。作者猜测原因：植物基因会控制特定的分类群，这些分类群行使的某些功能弥补植物自身的功能缺陷。

将这些可遗传的OTUs在进化树上标记出来，发现他们的种类还是比较多的，包括 26 Alpha变形菌纲, 9 Beta变形菌纲, 12 放线菌, 6疣微菌门, 和 8 拟杆菌门.

之前提到过的7个核心菌，其中5中也在可遗传的分类群中。

下一步工作计划：

1、利用GWAS或者其他相关的生物信息学技术，找到控制这些可遗传OTU的基因

2、利用宏基因组或者代谢组的方法，找到与功能更直接相关的特定微生物。

写在后面

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