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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

转录机制

一、RNA聚合酶和转录周期

1、

• 细菌：一种转录酶
• 真核：三种转录酶（植物+2种）
  • Pol I   大核糖体RNA前体
  • Pol II  几乎转录所有蛋白质编码
  • Pol III tRNA，小的核RNA基因，5S人RNA基因
  • （Pol IV、V 植物中，参与转录小干扰RNA）

细菌聚合酶的核心酶可独立合成RNA

• 2 * α + β + β'_大亚基 + ω
• 酶的形状像个蟹爪
• 钳子基部有活性中心裂隙
  • 依靠双金属离子催化合成反应
  • 位点结合一个Mg²⁺
  • 另外一个离子随人NTP进入随PPi释放
• 酶上有多种通道

2、由RNA聚合酶进行的转录是由一系列步骤完成的

• initiation
  • promoter 最初结合RNA聚合酶的序列
• elongation
  • 合成了10个碱基以后，便进入延伸阶段
• termination

3、转录的起始包含三个定义明确的步骤

• 闭合复合体的形成
  • 双链状态
  • 聚合酶结合在一个面上
• 转变为开放复合体
  • 双链在起始位点13bp距离内形成转录泡
  • 此时复合体叫：转录起始复合体（initial transcribing complex）
  • 最初10bp合成效率相当低，会不断合成小片段释放
  • 合成超过10bp，聚合酶逃离启动子
• 启动子逃离，进入转录起始阶段

原核的转录

二、细菌的转录周期

1、细菌的启动子在强度和序列上是多样的

• 原则上细菌RNA聚合酶核心酶可以在DNA分子的任意一点开始转录
  • 但是聚合酶不能打开双链
• 但是在细胞内 ，有σ起始因子的参与，聚合酶只在启动子处转录
• σ + 核心酶 = 全酶（holoenzyme）

细菌启动子元件有不同的组合情况

• 大肠杆菌最常见的σ因子是σ⁷⁰ 具有如下特征
  • 两段6核苷酸长的保守序列
    • -10， -35
  • 被长度17-19bp的非特异性序列隔开

• 启动的蛋白所识别的共有序列越相近，启动子越强
  • 单位时间内转录产物越多
• 启动子的强度 与以下因素相关
  • 启动子最初与聚合酶的结合程度
  • 异构化作用的支持效率
  • 此后聚合酶逃离的难易程度
• 这解释了表达水平的差异

• 较强的启动子中（如指导rRNA）有UP-element
  • 提供额外的特异性
• 缺失-35区的σ⁷⁰拥有上游延长-10区，以补偿
  • 大肠杆菌gal基因
• -10下游有鉴别子（discriminator）（都有？？）
  • 与聚合酶作用影响稳定性

2、σ因子介导聚合酶与启动子的结合（形成闭合复合体）

• σ⁷⁰ 有4个结构域

• -35 被区域4的两个螺旋形成 helix-turn-helix识别
• 一个插入-35 大沟，与碱基作用
• 另一个从大沟顶部横穿过，与骨架接触
• 与-35的结合提供能量确保聚合酶-启动子结合
• 这一种motif结构见于很多DNA结合蛋白（转录激活、抑制因子）

• -10 被区域2α螺旋识别
  • 螺旋包含几个芳香氨基酸
  • 可以与非模板链相互作用维持解旋DNA的稳定（类似SSB）
  • 区域2结合一个单链状态的-10element
  • 非模板链链上的两个碱基插入σ的口袋中

• -10 的延长序列被结构域3识别
  
• 鉴别子由结构域1、2识别
• UP-element 不被 σ 识别，被α亚基羧基端αCTD识别
• 区域3.2被称为3/4连接区

3、向开放式复合体的转变涉及RNA聚合酶和启动子DNA的结构变化

　　异构化作用（isomerization）

• 异构化作用不需ATP ，依靠优势构相驱动
• 异构化不可逆，开放式复合体形成后，转录随后起始
  • 相反，闭合式复合体的形成是可逆的

• 在活性中心内，DNA从+3位置开始分离
• 聚合酶后的上游DNA在-11位置重新恢复双链 σ因子 N 端（1.1）起到分子模拟物（molecular mimic）的作用（+电）
  • 结合DNA前，是1.1结合在活性中心

4、转录由RNA聚合酶起始，不需要引物

• 聚合酶需与一条或多条DNA模板链，起始核苷酸以及第二个核苷酸建立特异性作用
  • 严格控制方向
• 大多数转录物以同一核苷酸开始
• σ的3/4linker 与模板链互作，，确保正确位置和构象启动转录

5、转录的起始阶段RNA聚合酶保持位置不变，并将下游DNA拉向自己

• 三种模型
  • 瞬时漂移
  • 蠕虫移动
  • 蜷缩

• 单分子实验（FRET）支持蜷缩模型
  • 聚合酶下游的DNA被酶拉进来，在内部形成泡结构

6、启动子的逃离涉及聚合酶-启动子相互作用 以及

　　聚合酶核心-σ相互作用的破坏

• 一旦合成长度达到10bp，转录物变要穿入酶的RNA出口通道
• σ3/4作为分子模拟物占据RNA出口通道
• 合成达到10bp，RNA链便将σ3/4逐出
• σ也常常会从延长酶上丢失
• 逃离后，转录泡从22-24bp缩小为12-14bp
  • 这会释放能量，让聚合酶离开启动子并驱逐σ因子

有些生物如大肠杆菌噬菌体T7是单亚基聚合酶，没有σ因子，但也有类似的结构变化以让合成超过10bp的RNA穿出RNA通道

7、延伸聚合酶是一个边合成边校对的机器

• 增长中的RNA有8-9个碱基与DNA保持互补
• 聚合酶每前进相当于单核苷酸长度的一步，3'端添加一个核苷酸
• 转录泡的大小不变

转录酶的校对机制（proofreading）

• 焦磷酸编辑 pyrophosphorolytic editing
  • 是rNTP合成的逆反应
  • 错配导致合成速度减慢（空间位点不正确）
  • 聚合酶利用空间结构特性短暂限制PPi的离开
  • PPi + RNA_n = RNA_n-1 + rNTP
• 水解编辑 hydrolytic editing
  • 聚合酶倒退入rNTP进入通道（利用环境中的热,0°C不发生，37°C发生）
  • Gre因子（E.coli）、TFIIS（真核）进入
  • 水解

8、聚合酶可能会因为模板损伤停滞不前，需要被挪走

　　TRCF挪走停滞的聚合酶，并且招募修复酶

• TRCF结合上游双链（依靠ATP），并且寻找到停滞的RNA聚合酶
• 推动聚合酶向前合成，或者令三重复合体解离
• 招募转录藕联修复酶（UvrA、B、C）

9、转录由RNA序列内部信号停止

• Rho依赖型
  • Rho（ATP依赖）从rut位点结合单链
  • 寻找聚合酶
  • 将RNA扯出，或像TRCF一样作用

Rho的结合有特异性：

• Rut位点理想：40bp，不折叠为二级结构，富含C
• 不结合正在翻译的RNA
  • 故在细菌中，是等转录超过一个基因（编码序列）后才终止的

最近研究显示Rho因子是通过转录循环早期与RNA聚合酶结合

随着转录易位

易位导致紧绷

到一定程度，将酶终止

• Rho非依赖型
  • 非依赖型终止子也称固有终止子（intrinsic terminator）
  • 组成
    • 反向重复序列
    • 8个U
  • 形成发夹，引发相关信号，转录物脱离

真核的转录

三、真核生物的转录

• 真核生物的转录除了需要聚合酶外，还需要通用转录因子General transcription factor，GTF
• 在体内，由于有核小体，转录还需要
  • DNA结合调节蛋白
  • 中介蛋白复合体
  • 染色质修饰酶

1、RNA聚合酶II的核心启动子由4个不同序列的元件构成

• TFIIB识别元件
• TATA元件
• 起始子（Inr）
• 下游启动子元件（包括DPE、DCE、MTE）

　　核心启动子之外，存在的在体内进行有效转录所需的其他序列元件。共同组成调节序列

• 启动子最近元件（promoter proximal element）
• 上游激活物序列（upstream activator sequence，UAS）
• 增强子
• 沉默着子
• 边界元件
• 绝缘子

2、RNA聚合酶II在启动子上和通用转录因子形成前起始复合物

• TFIID由TBP（TATA Binding Protein)与TAF(TBP Associated Factor)组成
• TFIID 的TBP 识别TATA box
• 真核的启动子解旋需要TFIID的ATP水解介导
• 还需要聚合酶CTD磷酸化

3、启动子的逃离需要聚合酶的尾巴磷酸化

• Pol II 的CTD由连续重复7肽序列
  • Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
  • 每个重复序列都有激酶磷酸化位点
  • TFIIH的一个亚基由激酶功能

4、TBP用插入双螺旋小沟的β折叠来结合并扭曲DNA

• 结合的特异性来自插入到识别序列两端的碱基对，这由驱动DNA发生强烈弯曲的两对苯丙氨酸的侧链实现

5、其他通用转录因子在起始中也有特殊作用

6、体内的转录需要其他蛋白的参与，包括中介蛋白复合体

聚合酶的CTD尾巴结合有mediator，它有助于聚合酶分子定位到启动子

• mediator的一个表面结合Pol II CTD尾巴
• mediator另外的表面结合其他起始因子
• 如果缺失中介蛋白，常会导致一些基因失去表达
• 中介蛋白把聚合酶定位到不同的启动子上

• 在TFIIH水解ATP的介导下，双链打开，转录起始
• 加帽酶5’端加帽

7、一组新的因子激发Pol II 延伸 和RNA校对（proofreading）

• NELF ：负延伸因子
• DSIF ：DRB敏感因子
• 它们抑制早期转录，使得转录在+25 ~ +60处停止
• P-TEFb会使得重新开始转录
• 

8、聚合酶延伸过程中对抗组蛋白的阻碍

• FACT 通过暂时挪开一个H2A·H2B二聚体方便转录

9、延伸聚合酶与各种RNA加工所需的一组新蛋白质相互作用

• 5'端加帽
• 转录poly-A信号
• 相关蛋白募集
  • CSTF
  • CPSF
• 切割
• 多聚腺苷酸化
• 终止
  • 鱼雷模型较受认可
  • Rat快速消化正在合成的5'没有帽的RNA
  • 达到聚合酶时，将RNA链扯出消化

四、由聚合酶I和聚合酶III催化的转录

1、聚合酶I 聚合酶III识别不同的启动子，但仍需TBP

2、Pol I 只用于转录RRNA基因

• UBF结合UCE
• 引入SL1（由TBP与TAF组成)
• 募集Pol I 至核心启动子，激发转录

3、Pol III 的启动子位于转录起始点的下游