噬菌体疗法治疗细菌多重耐药添一篇好文

近日，派森诺生物与华东理工大学合作，在微生物基因组领域的《Applied and Environmental Microbiology》（影响因子4.813）发表新研究成果！在本研究中，从污水中分离得到了3种杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）噬菌体，并对其生物学行为进行了研究，其中新分离得到的噬菌体vB_AsM_ZHF对A. salmonicida亚种有抑制作用。研究结果表明，该方法可能是一种替代抗生素的方法来保护鱼类免受多药A. salmonicida亚种的感染。

研究背景

杀鲑气单胞菌 (A. salmonicida)是一种革兰氏阴性细菌，广泛存在于水生环境中，可感染多种商业鱼类，导致疖病和细菌性败血症。抗生素可预防和控制水产养殖中的杀鲑鱼感染，然而，随着细菌获得抗生素抗性基因，抗生素的功效会下降。从大菱鲆中分离出的A. salmonicida已对多种抗生素产生耐药性。因此，需要一些替代策略来预防和控制水产养殖中的耐多药（MDR）细菌。

噬菌体是感染细菌的病毒，噬菌体疗法已被用于控制人类、动物和植物病原体，许多成功治疗MDR细菌的方法已被报道。因此，噬菌体疗法有可能在临床上用作生物抗菌剂。在本研究种，一种剧毒的A. salmonicida亚种噬菌体 vB_AsM_ZHF (ZHF) 和其他两种噬菌体从污水中分离出来，并通过透射电子显微镜 (TEM) 鉴定为肌病毒科的成员，并对其进行全基因组测序和生物学特性验证。结果发现ZHF噬菌体治疗是一种潜在的水产养殖细菌性病害防治策略。

研究材料与方法

1.实验材料：从上海某水产市场污水中分离得到的3种A. salmonicida噬菌体， vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF。

2.测序平台： Illumina MiSeq

3.分析内容：噬菌体全基因组测序、进化树构建、ANI分析、easyfig比较分析、耐药和毒力基因预测、噬菌体生物学特性实验等等。

研究结果

A. salmonicida亚种的分离和表征

从中国山东省大菱鲆皮肤溃疡种分离得到一个白色菌落病原菌，命名为AS01。对其进行16S进化树构建发现该菌株为 A. salmonicida，但是很难区分其亚种。通过KPI体系和vapA序列进行鉴定，确定AS01菌株为 A. salmonicida subsp. masoucida亚种。

表1 16S鉴定中使用到的菌株

三种噬菌体的分离

从上海一家水产品市场的污水中分离出噬菌体，并根据它们的噬菌斑特征选择噬菌体进行扩增。TEM检测噬菌体形态和大小以区分菌株，并对这3种分离株进行鉴定和命名：vB_AsM_ZHA (ZHA)、vB_AsM_ZHD (ZHD) 和 vB_AsM_ZHF (ZHF)。根据国际病毒分类委员会 (ICTV) 分类系统 (16) 的形态学特征，所有分离株都被归入肌病毒科，尾状病毒目。噬菌体 ZHF 在双层琼脂板上形成清晰的斑块（直径为 3.28 + 0.25 mm），具有明显的晕圈，而 ZHA 和 ZHD 分别形成直径为 2.02+0.47 mm 和 0.51 + 0.15 mm 的混浊斑块。每个噬菌体都可以感染A. salmonicida，但是不能感染A. salmonicida subsp. salmonicida或其他测试物种。

图1 A. salmonicida phage vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF 的噬菌斑和形态图。

噬菌体的生物学特性

对这三个噬菌体的生物学特性进行研究：结果发现一步生长曲线显示三种噬菌体的生长速率相似，噬菌体 ZHA、ZHD 和 ZHF 的上升期分别为 30、30 和 20min，破裂大小为 110、39 和 284 PFU/细胞；把噬菌体置于各种环境下繁殖以评估稳定性，结果发现每个噬菌体在 36°C 下在 6 至 8 的 pH 水平下保持活性，当PH<3并且温度高于50°C时，噬菌体滴度急剧下降。研究发现，在 MOI 为 1 时，噬菌体 ZHA 的最高产量约为 2109 PFU/ml。ZHD 和 ZHF 的最佳 MOI 为 0.1，噬菌体滴度达到约 3109 PFU/ml（图 2D）。

图2 A. salmonicida噬菌体vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD和vB_AsM_ZHF的生物学特性。

A. salmonicida亚种的生长曲线结果表明，在0.01至100 MOI的前25h内，每个噬菌体分离物都表现出可接受的抗菌能力。在100 MOI条件下，噬菌体ZHD 感染的杀鲑鱼在25h开始重新生长，而用ZHA和ZHF感染的菌株分别在40h和45h恢复生长，其中感染噬菌体ZHF的细菌在60h时恢复率最低。该菌株的爆裂尺寸最大、细菌再生时间最长、最适MOI最低，这些特征表明，ZHF对A. salmonicida subsp. masoucida的体外生长具有最好的抗菌活性。因此，噬菌体 ZHF 用于后续的实验研究。

图3 显示噬菌体 (vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD 和 vB_AsM_ZHF) 在 MOI 为 100、10、1、0.1 和 0.01 时对A. salmonicida (AS) 生长的抗菌作用的生长曲线。

噬菌体 vB_AsM_ZHF 的基因组分析。

噬菌体ZHF基因组是一个线性DNA，由 161,887 bp 组成，GC 含量为 41.24%；ORFs 237个，占基因组的149,784 bp（92.52%），平均长度为632 bp。ORFs由40个结构和包装蛋白基因、27个DNA复制/修饰基因、16个转录调控基因、14个代谢基因、3个宿主裂解基因和107个假设蛋白基因组成。毒力基因和耐药基因分析并未发现相关基因。ZHF可能是一种毒性噬菌体，因为在基因组中未发现整合酶基因，使其成为适合噬菌体治疗的噬菌体。

ANI分析结果显示，没有已知的噬菌体基因组与ZHF基因组表现出 100% 相同的序列同源性，这证实了它的新颖性。全基因组序列比对表明，与其他噬菌体菌株相比，噬菌体 ZHF 与气单胞菌噬菌体相似性更高。虽然A. salmonicida噬菌体AS-gz的多个基因在基因组中的排列方式不同，但它们在 ZHF 中保留了高 ANI 值。噬菌体 phiAS4 和 AES508 以及窄食单胞菌噬菌体 IME13 的许多基因序列与ZHF相同。其他被分析的噬菌体具有与 ZHF 同源的结构蛋白，但与其他蛋白质的相似性较少。

图4 杀鲑鱼噬菌体vB_AsM_ZHF的基因组特征及比较分析。

噬菌体 vB_AsM_ZHF 对A. salmonicida subsp.masoucida的治疗效果。

在大菱鲆中建立A. salmonicida subsp.masoucida的挑战模型，每组20只大菱鲆接受 1104、1105或1106 CFU/鱼的i.m.挑战。接种后 20 天 (dpi) 的存活率分别为 60%、10% 和 0%。选择 8104 CFU/鱼作为A. salmonicida subsp.masoucida的攻击剂量，在接下来的实验中大菱鲆感染了该菌，通过ZHF治疗发现，ZHF有可能保护大菱鲆免受A. salmonicida subsp.masoucida的侵害。

图5 用 8 * 104 CFU/鱼和噬菌体 vB_AsM_ZHF (ip) 以 8 * 102 PFU/鱼 (MOI 为 0.01)、8 * 104 PFU/鱼的剂量处理的大菱鲆的存活率。

在体内评估细菌负荷和噬菌体滴度，以表征ZHF对A. salmonicida subsp.masoucida的动态特性，结果发现在肝脏和脾脏中细菌负荷和噬菌体滴度的变化趋势相似。在最初的2天，肝脏和脾脏中未检测到细菌定植，但在接下来的几天中逐渐增加。与 104 CFU/g 的阴性对照相比，治疗组的细菌负荷上升至约 103 CFU/g。在头肾组织中，治疗组的细菌负荷在8天内保持低于阴性对照，并且稳定增长。在前2天，治疗组和对照组之间的噬菌体滴度没有差异，但治疗组的噬菌体滴度比对照组下降得更慢。在肝脏和脾脏中，处理组中噬菌体滴度迅速下降8 dpi；而在对照组中，噬菌体ZHF被完全清除。与其他器官相比，头肾组织中清除ZHF的速度更慢。综上所述，ZHF有效地减轻了头肾组织感染的细菌负担，大菱鲆的免疫系统对噬菌体的清除具有延缓作用。

图6 1、2、4 和 8 dpi 时肝脏、脾脏和肾脏中的细菌负荷（左轴）和噬菌体滴度（右轴）。

A.salmonicida subsp. masoucida 的抗炎作用。

肌肉组织病理切片显示，A. salmonicida subsp. masoucida在8dpi时可导致炎症细胞浸润，噬菌体治疗后可显著减少炎症细胞的数量进而达到对照组的水平。ZHF相对于细菌感染组1至4 dpi降低血清中白细胞介素1b（IL-1b）水平，并且在8 dpi时血清TNF-a和γ干扰素（IFN-g）水平低于对照组dpi。炎症因子（IL-1b、IL-6、IFN-g、转化生长因子 b [TGF-b]、肿瘤坏死因子 α [TNF-a] 和铁调素）在 1、2、4、通过实时定量 PCR 测量肝脏、脾脏和头肾中的 8 dpi，并通过热图进行可视化 。治疗组的 TGF-b 水平高于感染组，尤其是在 8 dpi 时。相比之下，治疗组第8天IL-1b、第1天IL-6、第2天和第4天脾脏中的IFN-g、第8天铁调素水平低于感染组。这些结果表明，噬菌体疗法有效地降低了体内炎症水平。

图7 体内噬菌体疗法的抗炎作用

研究结论

从污水中分离了一种新的A. salmonicida subsp. masoucida噬菌体ZHF，并对其生物学特性进行了鉴定；
对全基因组进行测序分析，未发现抗生素耐药性或毒力基因；
噬菌体治疗模型在大菱鲆体内建立和验证了给药方法，结果发现ZHF显着降低了死亡率、细菌负担和炎症反应，且没有明显的副作用。

综上所述，本研究代表了一种开发噬菌体疗法来控制多重抗生素耐药性A. salmonicida subsp. masoucida的策略。

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