【方法篇】基于LC-MS/MS手段分析与MHC结合的肽序列

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肽抗原与主要组织相容性复合体（MHC）编码的分子结合，并呈现在细胞表面形成T淋巴细胞的靶分子。自适应免疫系统这一关键环节可有助于消灭病原体感染细胞和癌症细胞，以及产生相应抗体，那么对这些抗原肽的鉴定，给新疫苗开发带来新的契机，新疫苗的目标就是产生有效的适应性免疫。在《Nature Protocols》上科学家发现了一种通过使用LC-MS/MS的方法对这些抗原肽进行分析的方法。

该方法通过对MHC-肽段复合物进行免疫亲和捕获着手，然后提取其中的抗原肽并采用反向高效液相色谱-质谱技术（LC-MS/MS）对其进行分析，从而能鉴定各种细胞上的抗原肽。

T淋巴细胞对外来抗原识别是适应性免疫的基础，具体来讲，胞内抗原在胞浆中降解，抗原前体肽在胞浆中降解转运到内质网，在这里它们被进一步修剪成短肽（8-11AA），可以与HLAs class I类分子组装。这些肽-HLA class I复合物逐渐消退，并被CD8+ T细胞仔细检查，以寻找与健康细胞环境中不同的外来抗原肽。不同的、致病的或者突变的抗原肽最终会促使细胞感染随后通过免疫细胞清除。另外外源性抗原也可以被专门的抗原呈递细胞吸收，并在细胞内小室降解。由此产生的肽（10-20AA）随后可由II类HLA分析吸收并呈现在细胞表面上。通过抗原特异性CD4+ T细胞识别这些复合物活化T细胞和体液免疫的产生，抗原产生到呈递到细胞表面传递细胞内外通讯的这一免疫过程又可称为免疫监视，通过T淋巴细胞检查内源性蛋白表达（CD8+T细胞I型HLA）或者外源性抗原表达（CD8+T细胞I型HLA）。

图1

不像标准的蛋白质组学方法，通过使用蛋白酶水解后产生的肽段通过液质联用进行分析，研究HLA结合的肽段具有非常大的难度和挑战，原因有三个如下所示：

首先，目前肽-HLA复合物的确切水解机制不清楚并且十分复杂，过程中许多蛋白酶和肽酶会参与其中从成熟的复合体中酶解出许多肽段；

其次，与单纯胰酶酶解蛋白所产生的肽段相比而言，HLA分子结合的大部分肽段在长度、序列都非常接近。

最后，与之相比，HLA结合的抗原肽丰度都相对较低。

实验流程

因此，科学家设计了从较复杂组分中分离这些肽段方案，通过采用反向高效液相色谱法（RP-HPLC），其中，根据研究者经验看，所得到的肽段丰度提高了十倍。此文中图2中所示一种完整基于HLA结合肽段的分离、鉴定和验证的实验流程图。

图2

方法的局限性

直接对HLA结合的肽段进行生化分析，同时能否提供一个对这些肽段真正无偏倚的测量方法，仍然具有局限性。

覆盖范围受到可用于分析的材料数量的限制；仅对小样本而言，最丰富和最容易检测到的肽只有数百个，在很多案例中，检测受到限制都是由于其表位的化学性质：从通常使用的脱盐介质上的洗脱能力，如C18在预分馏和随后的液相处理，由于电离能力的限制，可能导致分子的检测受到损害；采用了一种策略，在MHC I类分子的C端添加一个亲和标签，这样就可以在研究前进行免疫亲和反应。

实验设计

实验设计包括选择感兴趣的HLA分子，需要选择适合的控制实验的方法；例如，对于感染和肿瘤细胞，需要使用其对应的健康细胞，对于HLA或抗原转染的抗原呈递细胞（APCs），则应选择未转染的亲本细胞系，或不含HLA的细胞系。尽管不全是样本的限制问题，从数据中得出有意义的结论需要设置三次生物学重复，尤其是比较两种不同状态的研究尤为重要；例如，模拟细胞与感染细胞或比较肽的同质异形体。

常规的实验设计可能包括鉴定来自病原体的HLA复合物并利用功能检测方法评价其免疫原性。每个实验室都需要有一个优化好细胞株可进行优化和质量控制（例如，任何一种常见的B淋巴细胞系中表达特定的HLA I 类和II类等位基因的细胞株），此外比较HLA表达量能够控制实验中试剂的使用量（例如抗体，和亲和的凝胶）。

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