Jackson公司蛋白质印迹指南丨样品制备

如今，蛋白质印迹广泛用于分子生物学、生物化学和细胞生物学中，以检测生物样品中感兴趣的特定蛋白质。该技术提供了有关目标蛋白的信息，包括丰度和分子量，并提供了一种检测蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰的方法。

Jackson公司Western印迹分六个阶段进行：

1.样品制备

2.通过凝胶电泳分离蛋白质

3.蛋白质转移（电印迹）到膜上

4.膜阻塞

5.免疫检测

6.可视化

蛋白质印迹可用于检测天然和合成来源的蛋白质。来自表达系统的重组蛋白和来自生物样品的内源蛋白都可以用蛋白质印迹法检测。

对于要通过蛋白质印迹分析的蛋白质，必须首先处理包含它们的样品，以使目标蛋白质可用于分析。例如，在筛选表达时，通过裂解细胞提取蛋白质以释放蛋白质，使其进入分离基质。

蛋白质提取之后可以进行变性和还原以将蛋白质转化为其一级结构，这使得它们可以在电泳期间通过它们的分子量进行分离。

SDS-PAGE使用 SDS 包裹蛋白质，掩盖其固有电荷并赋予与它们大小成正比的整体均匀电荷。

然后将样品加载到凝胶中，并施加电压。蛋白质向正J迁移。凝胶的密度阻碍了它们的迁移，使它们能够按大小分开。分离后，通过将凝胶和膜直接接触并施加电场将蛋白质拉入基质中，将蛋白质转移（电印迹）到膜上。

蛋白质转移之后是封闭步骤，该步骤使用蛋白质溶液来最大限度地减少非特异性相互作用。然后将膜与特异性结合目标蛋白质的一抗一起孵育。

在进一步的封闭步骤之后，偶联的二抗与一抗结合，从而使靶蛋白可视化。

比色或化学发光底物都可用于显示来自报告酶偶联物的信号。使用成像设备检测来自荧光染料偶联物的信号，并可用于同时检测多个目标。

蛋白质印迹是一种常规实验室程序，可以检测和分析许多蛋白质及其相互作用。蛋白质印迹的成功取决于抗体-抗原相互作用的特异性以及添加二抗的信号放大潜力。这些因素使蛋白质印迹J其敏感，能够检测低至皮克水平的蛋白质。根据试剂的种类和检测方法的不同，可以获得半定量和定量的结果。

蛋白质印迹可以高效可靠地进行，以产生高质量的印迹。本指南将帮助您选择正确的试剂、选择合适的抗体和检测方法以及排除实验故障。

Jackson公司样品制备：

在电泳过程中准确分离蛋白质是蛋白质印迹的关键步骤。它依赖于正确处理的样品，以便感兴趣的蛋白质处于可以通过凝胶迁移的形式。

可以通过蛋白质印迹分析来自各种来源的蛋白质。样品可能来自蛋白质表达系统，例如哺乳动物或细菌细胞培养物，或来自临床组织样品，每种样品都需要不同的处理来产生最终用途的优质蛋白质。这些蛋白质提取方法详见表（1）；然而，对于蛋白质印迹，通常不需要如此严格地处理样品。

由于免疫印迹的特异性，可以对用于蛋白质印迹的样品进行粗略处理，以便提取蛋白质并将其转移到适合将样品引入分离凝胶进行电泳的溶液中。由于存在诸如 DNA 之类的聚合生物分子，粗样品尤其可能是粘性的，并且可能会影响凝胶加载。

Jackson公司细菌培养的示例样品制备过程：

取 1 ml 大肠杆菌培养样品并转移到冰上的微量离心管中。

在 4°C 下以 13,000 rpm 转速旋转 20 分钟。

弃去上清液。

在 50 µl 上样缓冲液中重悬细胞，并在 100°C 下煮沸 5 分钟。

13,000 rpm 离心 5 分钟。

加载。

Jackson公司贴壁细胞例如哺乳动物 (HEK293) 的示例样品制备：

将组织培养板放在冰上，用冰冷的 PBS 清洗细胞。

吸出 PBS，然后加入适当体积的裂解缓冲液（例如 1 mL 每 107 个细胞/100 mm 培养皿 150 cm² 烧瓶；0.5 mL 每 5×106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm² 烧瓶）。

使用细胞刮刀从孔/烧瓶中分离细胞，然后用移液器吸头或通过胰蛋白酶消化搅拌。

将细胞悬浮液转移到预冷的微量离心管中。

然后在 4°C 下对样品进行微量离心。条件取决于细胞类型，应根据您的实验设置确定。例如，HEK 293 可以在 1000 rpm 下耐受 15 分钟。

从沉淀的细胞中吸出上清液并转移到冰上的新鲜试管中。

将负载染料添加到上清液中并在 100°C 下煮沸 5 分钟。

细胞沉淀也可能与上清液一起加载了染料。

将样品以 13,000 rpm 的速度旋转 5 分钟，然后加载到凝胶中进行电泳。

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