ELISA标准曲线的绘制方法

许多试剂检测都涉及到标准曲线的问题，究竟如何绘制或制作标准曲线呢？

用Excell和SPSS的软件能做出来吗？，怎么操作？能一起求出计算公式吗？

有没有专门的软件来处理呢？介绍几种？

希望有这方面经验的介绍自己的经历，与大家分享，“与众同乐才是真的快了”

的确，标准曲线做的好与坏会直接影响到实验的结果，甚至是关系到实验的成败。

首先，做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意：

1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。

2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

4、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

5、标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。

6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999.

怎样绘制标准曲线？

标准曲线浓度得到后，可通过计算器、Excell或SPSS统计软件进行绘制，并得到相关的回归方程(即计算公式)和相关系数(回归系数)，个人认为，Excell软件比较好用一些；SPSS也行，不过是英文的，初学者不是很容易掌握；计算器嘛太麻烦了，所以现在一般不用。

双抗夹心法ELISA 拟和曲线：

拟和曲线：

打开EXCEL软件；在工作表中

输入第一行： 浓度值， 如0 10 50 100 400

输入第二行：该浓度下的调整後的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42

选择这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表向导，在“标准类型”中选择“xy散点图”；在“子图表类型”中选择“折线散点图”，按“下一步”；选择“系列产生在行”，按“下一步”；数据标志，可以填写：如数据y轴，OD值；数据x轴，浓度；按下一步，点击完成。可得曲线图。

单击曲线，按右键，选择“添加趋势线”，在类型中，选择多项式；在选项中，选择显示公式，选择显示R平方值。得到公式和R平方值。

也可以用上面说的方法，在公司已经提供的图表上， 双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和新的曲线。

计算浓度：

举例：第一次实验：

标准曲线为：

y = -4E-05x2 + 0.026x+0.1

R2 = 0.9745 为例，已知OD值，计算浓度。

由于y = -4E-05x2 + 0.026x+0.1，所以可以得到：

4E-05x2 －0.026x ＋(y-0.1)＝0

ax2 ＋bx ＋C＝0

a＝4E-05；b＝ －0.026； C= y-0.1

x＝(－b－(b*b－4a(y-0.1))(平方根)) /(2*a)

代入a，b，和y值，得

x＝(0.026－(0.026*0.026-0.00016*(y-0.1))(平方根))/(2*0.00004)

在excel里可以用以下公式表示：

x＝(0.026-EXP(LN(0.026*0.026-0.00016*(y-0.1))/2))/(2*0.00004)

通用公式为： Y=ax2 ＋bx ＋C

x＝(－b－EXP(LN(b*b－4a(y-c))/2))/(2*a)

您可以应用excel的公式拷贝功能，计算所有浓度。

简化方法

如果有示例的excel表格，过程可参照附件的EXCEL表格，您的新数据可以这样拟和：双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。

根据曲线方程序，更改公式的参数，计算出浓度。

竞争法拟和曲线 －－－－Logit-log 直线回归

竞争法一般情况下用Logit-log 直线回归的方法可以拟和成近似一条直线；

令 p = OD/OD0, q = 1 - p,

y = ln (p / q), x = lg (浓度),

其中: OD 为反应值,

OD0 为浓度为 0 的反应值的均值,

则方程为:

y = a + b*x