Digital Spatial Profiler

新一代高维度空间组学技术

摘要： Digital Spatial Profiler（DSP）是一种专门针对肿瘤免疫和肿瘤微环境设计的空间多靶标技术，该技术在2019年AACR一经推出就受到全球肿瘤学家和肿瘤免疫学家的热捧。本文通过对“Immunologic alterations in the pancreatic cancer microenvironment of patients treated with neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy”和“Biomarkers Associated With Beneficial PD-1 Checkpoint Blockade in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Identified Using High-Plex Digital Spatial Profiling“两篇文章的解读，详细介绍了DSP技术在肿瘤微环境、生物标志物中的应用。

技术简介： 2019年， NanoString公司联合MD安德森等多家研究单位共同开发的一项全新的、基于光学与探针技术的蛋白组学和转录组学技术平台。非因生物成为官方合作伙伴，也是全球8个DSP技术服务中心之一。

应用前景： DSP技术将表达谱的多重定量信息与组织原位信息进行整合，可在一张石蜡组织切片上实现多达上百种蛋白和上千种mRNA的原位共分析，将组织病理学、肿瘤免疫与表达谱完美结合，在肿瘤微环境研究、肿瘤异质性与肿瘤免疫研究中有着强大的优势。

研究背景

随着癌症免疫治疗的蓬勃发展，肿瘤微环境，空间异质性与肿瘤免疫、靶向治疗以及传统放化疗的关系越来越受到研究者的关注。癌症研究也从单纯的以肿瘤细胞为核心的方向逐渐过渡到了将传统靶向治疗与免疫相结合的时代，而且深度剖析复杂肿瘤微环境的机制与变化成为了目前癌症研究和转化医学的热点之一。2012年以后发展起来的单细胞技术(Single-cell RNA-Seq/CyTOF)已从一个较深的层次解析了先前在混杂样本中发掘不到的信息。然而在癌症研究中，仅从细胞分群或特殊亚型细胞的鉴定作为生物标志物或指导临床治疗并与预后相关联仍面临巨大挑战。因此如何将细胞的转录组学以及蛋白组学信息定位到组织原位则成为一个新的研究方向，而将空间信息与单细胞表达谱信息以及传统多组学信息更好的结合起来，将成为肿瘤靶向治疗未来的发展方向。

从组织原位找寻多组学信息是传统病理学金标准的研究基础，然而提高分析靶点通量一直是一个技术瓶颈，也是肿瘤学家、免疫学家以及靶向药物研发者所关注的热点。目前大多数关于分子诊断或者生物标志物的临床应用，往往是基于单一组织活检，传统病理金标准可以得到组织形态学和少数标志物表达状况的信息，但是可分析靶点数目很难从少量的组织样本中获得，同时基于病理学家的人为判断作为评判标准本身就存在局限性。基因测序技术的发展可以实现在混杂组织中测得低丰度的突变信息，然而在表达谱层面，仅有少数癌种可以在一定的技术条件下实现转录组层面的分析检测，其中最为突出的就是乳腺癌术后复发风险评估，如PAM50基因（nanoString），Oncotype DX 21基因，MammaPrint 70基因和EndoPredict 12基因等。在大多数实体瘤中，由于复杂的肿瘤异质性和微环境的互作，很难从大块组织中获取到准确的基因表达谱信息，从而导致可能具有重要诊断或预后的生物标志物信息被掩盖（如图1）。

图1 大块组织无法获得准确的基因表达谱信息

在肿瘤微环境研究中，我们往往会关注某个亚组织层面上的表达谱信息，诸如比较不同表型病人间肿瘤中心、边缘、浸润淋巴细胞及其亚群（肿瘤浸润淋巴细胞TIL/肿瘤关联巨噬细胞TAM/三级淋巴结构TLS等）、周边淋巴细胞、基质、成纤维细胞以及特殊形态学或标志物标记的细胞亚群和它们的相互关系。非因生物的DSP数据空间分析技术则为这个层面的研究提供了一个强有力的技术支持。它不仅可以在空间层面上实现细分，并可以同时对组织进行转录组和蛋白组的共分析，且在蛋白组层面的Multiplexing通量可以达到前所未有的90种之多，包括了当前肿瘤免疫最为火热的靶点研究，免疫细胞分类，激活水平，检查点抑制剂，肿瘤凋亡，肿瘤细胞信号等，比现有基于单细胞或多种免疫组化以及循环免疫荧光的技术更有优势，也更具稳定性。在转录组层面，DSP的Cancer Transcriptome Atlas (癌症转录组图谱)则涵盖了50多条与肿瘤生物学、免疫、代谢及其它相关的1800多个基因，可以全景分析肿瘤微环境中复杂的生物学机理。不仅如此，DSP还能将临床样本的可用性发挥到最大化，可针对石蜡切片（FFPE样本），组织芯片（TMA）以及新鲜冰冻样本进行高维度蛋白和RNA的空间分析，更易与其它组学以及临床信息整合，深度挖掘和探索肿瘤微环境变化的奥秘。该技术作为一项革新性的技术在2019年的AACR年会上刚刚推出就得到业内极大关注，Clinical Cancer Research杂志以封面文章报道了耶鲁大学转化医学和病理学系主任David Rimm教授运用DSP技术在黑素瘤中的开创性工作，奠定了该技术应用的未来（如图2）。

图2

该研究利用组织芯片（TMA），连续运用3个样本集（cohort）对DSP技术进行了对比验证，预后标志物验证和新的生物标志物发掘。Rimm组首先将DSP与QIF（quantitative immunofluorescence AQUA）技术进行比对，得到了DSP与AQUA在不同组织区域的CD3,CD4,CD8,CD20以及PD-L1的表达相关性数据，验证了该技术的可靠性。然后再通过这两个技术在非小细胞肺癌（NSCLC）样本中验证了已知的CD3标志物在基质区域和肿瘤富集区域与预后的相关性。最后通过对黑素瘤TMA中的44个蛋白指标进行DSP分析，通过三重荧光染色将组织原位对应的巨噬细胞（CD68），淋巴细胞（CD45）以及肿瘤细胞（melanocytes）区域通过masking方式区分开，并进行高精度多重定量。研究者发现了之前在bulk样本层面或无空间信息支持下所不能发现的新研究结论，PD-L1与CD8的表达在巨噬细胞高表达区域（CD68+富集ROI）与预后存在强相关（PFS/OS），而这两个蛋白的表达在总淋巴细胞区域（CD45+）则不存在相关性。同理，B2M的表达在CD45富集区域与预后存在强相关性。因此，将肿瘤微环境空间信息与高通量表达谱技术相结合，为生物标志物的探索和开发开辟了新方法和技术路径。

深度解析

作为癌症空间组学强有力的研究新技术之一，DSP也逐渐成为了寻找生物标志物的焦点技术。2020年1月，Matthew R. Farren等利用nCounter与DSP技术联用，寻找免疫生物标志物并发表“Immunologic alterations in the pancreatic cancer microenvironment of patients treated with neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy”（如图3）。

图3

在该项研究中，研究者以胰腺癌FFPE样本作为研究对象，针对4种临床治疗策略选取了24例样本（如图4），首先利用nCounter表达谱技术探寻不同治疗方法间的基因表达差异，再通过生物信息学对基因组富集、蛋白质相互作用富集、分子复合物检测以及EnrichR分析启动子进行分析，然后再通过DSP技术分析胰腺癌肿瘤微环境中各种免疫相关蛋白标记物的数量和空间分布的变化。

图4

研究者首先通过nCounter技术，利用包含770个基因的Pan-Cancer Immune Profiling Panel鉴定出189种差异表达基因（如图5、图6）。

图5

图6

同时运用DSP分析了样本里基于肿瘤微环境的各种免疫相关蛋白标记物的数量和空间分布的变化，通过对肿瘤富集区，基质区域，免疫细胞富集区域的分群，分析了210个兴趣点（Region of Interest，ROI）中的27个关键蛋白表达状况，ROI包括71 肿瘤区域（24个Surgery Only+ 23个FOLFIRINOX+24个F+SBRT）、70 免疫区域（24个Surgery Only+ 24个FOLFIRINOX+22个F+SBRT ）、69 基质区域（ 22个Surgery Only+ 24个FOLFIRINOX+23个F+SBRT ），如图7。

图7

研究发现在肿瘤富集区域，新辅助治疗与信号通路、细胞存活通路的改变以及VISTA的表达相关。AKT、β-Catenin、STAT3、Ki-67和BCL2的表达水平在三组样本中有显著差异（A）；CD44和VISTA的表达水平在三组样本中有显著差异（B）；CD4，CD45，CD56，CD68的表达水平在三组样本中有显著差异（C），如图8。

图8

在免疫细胞富集区域，新辅助疗法与granzyme B 和PD-L1的高表达相关；F+SBRT与T细胞标记物及抗原刺激的T细胞标记物的低表达相关（如图9）。在基质区域，信号和检查点分子的差异（尤其是 PTEN，β-catenin，BCL2和Ki-67 ）与新辅助治疗相关；PD-1和VISTA的表达水平在不同组间有显著差异（如图10）。该研究充分证明了在生物标志物开发中，我们需要将空间信息纳入到分析中去，先前的高通量表达谱技术和低维度的组织原位分析技术都存在这方面的劣势，而非因生物的DSP技术刚好解决了这一研究瓶颈，为肿瘤微环境研究提供了更多的研究方法和策略。

图9

图10

今年4月，David Rimm组用同样的方法，在Clinical Cancer Research杂志上发表题为“Biomarkers Associated With Beneficial PD-1 Checkpoint Blockade in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Identified Using High-Plex Digital Spatial Profiling”的研究性文章（如图11）。该文章沿用了先前黑素瘤的研究策略，运用TMA样本结合DSP技术发现了在非小细胞肺癌中，免疫细胞富集区域的CD56、CD4表达与预后有关。

图11

研究者通过在非小细胞肺癌患者样本中使用DSP技术，对44个肿瘤免疫学高度相关的蛋白进行原位测定，意在开发与预后、免疫治疗有效性相关的靶标，然后根据多重免疫荧光及细胞计数数据，采用正交实验法，对结果进行验证。

研究人员首先对67个接受了肿瘤免疫疗法单一治疗的非小细胞肺癌组织进行了荧光染色，根据癌组织（panCK），淋巴细胞（CD45）, 巨噬细胞（CD68）和非淋巴细胞基质细胞的表达对这四个不同区域进行了划分。（如图12）

图12

CD68 [Red](Macrophages)、CD45 [Yellow](all lymphocytes except macrophages)、panCK[Green](Tumor)、Remaining area[Purple]non-immune stroma.

在此形态学指导下，利用DSP技术，对3个不同分组区域的44个蛋白靶标同时进行分析，并与预后信息相结合，一次性筛选出6个与PFS相关的生物标志物，17个与OS相关的生物标志物（如图13）。

图13

经多变量分析，空间定位在免疫细胞富集区域筛选出CD56、CD4两个与两种预后指标均相关的生物标志物（如图14）。通过多重免疫荧光及细胞计数等数据的进一步验证，发现在非肿瘤区域CD56+细胞与基质区域细胞数的比值，与预后指标紧密相关（如图15）。

图14

图15

总结

从以上几项研究中不难发现，肿瘤的免疫疗法正在向着精准化、个体化发展，同时多维度多组学的空间研究也成为发现免疫标志物的重要手段。

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