Nano Today（IF=21）| 北京大学齐宪荣团队通过原位重编程巨噬细胞增强肿瘤免疫治疗效果

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肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 在肿瘤微环境中含量丰富，并通过多种机制促进肿瘤进展。CD47 在大多数恶性肿瘤中过度表达，并作为“不要吃我”的信号来抑制吞噬作用。利用CRISPR/Cas9 技术敲除 CD47，理论上保证持久的抗肿瘤免疫反应。然而，重编程的 TAM 易受抑制性细胞因子的影响，并倾向于转化回 TAM，单独的 CD47 阻断可能不足以引发有效的免疫反应。

2021年12月24日，北京大学齐宪荣团队在Nano Today（IF=21）上在线发表了题为”CRISPR-based in situ engineering tumor cells to reprogram macrophages for effective nano todaycancer immunotherapy“的研究论文，该研究将 CD47 阻断与免疫激活细胞因子 IL-12 相结合，通过将肿瘤细胞基因工程改造为 IL-12 工厂以原位重编程 TAM，从而获得协同抗肿瘤功效。

首先，该研究设计了一种名为 HPT-PFs 的基因递送系统，该系统经过透明质酸 (HA) 和肿瘤微环境敏感肽 (TMSP) 双重修饰，可同时递送用于 CD47 敲除和 IL-12 生产的质粒。由于 HPT-PFs 载体的肿瘤特异性转染和优异的内体逃逸能力，超过 27% 的肿瘤细胞在 HPT-PFs 介导的基因编辑后失去了 CD47 表达，从而引发巨噬细胞的吞噬作用。并且在 HPT-PFs 介导 IL-12 表达后，肿瘤细胞产生了高于 500 ng/ml 的 IL-12，表明肿瘤细胞成功工程化为 IL-12 工厂。在黑色素瘤小鼠模型中，当 CD47 敲除与 IL-12 产生相结合时，观察到 M1 极化 TAM和炎性细胞因子分泌的急剧升高，这导致肿瘤生长的显着抑制。总之，这项研究表明，CRISPR介导的CD47阻断与肿瘤细胞中IL-12产生的结合可以协同促进巨噬细胞介导的免疫治疗，为基于CRISPR的原位工程肿瘤细胞进行有效的免疫治疗铺平道路。

癌症免疫疗法彻底改变了癌症治疗领域，并在各种肿瘤中显示出有希望的疗效。与传统的直接杀死肿瘤细胞的化疗和放疗不同，免疫治疗利用免疫系统的防御功能来检测、识别和攻击肿瘤细胞，可分为肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、过继性T细胞治疗和免疫系统调节剂。其中，免疫检查点抑制剂被认为是最有前景的，已有数款免疫检查点抑制剂获得FDA批准。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境以及肿瘤细胞与免疫系统之间的串扰，acs nano 影响因子免疫检查点抑制剂的反应率仍然很低，只有 20-30% 的患者对其有反应。

肿瘤微环境由多种细胞组成，包括肿瘤细胞、T细胞、调节性T细胞（Treg）、成纤维细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。TAM 在肿瘤中含量丰富，占肿瘤质量的近 50% ，它们的存在通常与肿瘤进展不良有关。例如，TAM 可以分泌抑制性细胞因子，如 IL-10 和转化生长因子-β (TGF-β)，并消耗 L-精氨酸等代谢物，从而直接抑制细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 反应。此外，TAM 可以促进血管生成、增强 Treg 细胞募集和抑制T细胞浸润以支持肿瘤生长。考虑到TAM在肿瘤进展中的关键作用，靶向 TAM 进行肿瘤治疗引起了相当大的兴趣，可分为 TAM 消耗和 TAM 激活。前者非选择性地消耗巨噬细胞并可能导致意外风险，因为巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分；后者旨在重编程巨噬细胞以恢复其肿瘤杀伤功能以进行有效的肿瘤治疗，此类药物包括抗 CD40 抗体、toll 样受体激动剂、BTK-PI3Kγ 信号传导抑制剂和 CD47 阻滞剂。

CD47-一种膜结合蛋白，在大多数恶性肿瘤中过度表达，通过与TAMs上的信号调节蛋白α(sirpα)相互作用，抑制吞噬功能，起到“不要吃我”的信号作用。阻断CD47与sirpα相互作用的治疗策略已经在癌症治疗中显示出有效性，例如针对CD47的抗体、沉默CD47的RNA干扰以及针对调控CD47转录和/或运输的通路的药物。然而，这些策略的阻断作用是暂时的，并不能保证持久的抗肿瘤免疫反应。此外，抗体与正常细胞的不必要结合以及RNAi潜在的非靶点效应可能会增加与免疫相关的不良反应的风险。由于其简单性和多功能性，nano dimension由CRISPR/CAS9进行的基因编辑在癌症治疗中显示出巨大的前景。CRISPR/Cas9基本上由两个关键模块--Cas9和sgRNA组成。在sgRNA的指导下，Cas9可以特异性地切割靶序列，导致基因敲除。

然而，重新编程的TAMs很容易受到肿瘤微环境中的抑制性细胞因子如IL-4、IL-13、IL-10和M-CSF的影响，并倾向于转化回TAMs，仅靠CD47阻断可能不足以诱导有效的免疫反应。因此，CD47阻断与肿瘤微环境重建相结合，为有效的抗肿瘤免疫治疗提供了巨大的希望。白细胞介素12(IL-12)是一种由巨噬细胞和树突状细胞自然分泌的免疫激活细胞因子，已被证明能抑制肿瘤血管生成，促进T细胞增殖，并诱导TAM极化。由此推测，CD47阻断和IL-12原位产生相结合可以协同促进TAMs由支持表型向抑癌表型的转变，从而发挥巨噬细胞介导的免疫治疗作用。然而，质粒的大小和大量的负电荷严重阻碍了它们的细胞摄取和后续的治疗效果。为了最大限度地发挥抗肿瘤作用，需要一种能同时传递CD47阻断质粒和IL-12表达的肿瘤靶向递送系统。

利用肿瘤中高表达的CD44受体和基质金属蛋白酶(MMPs)，该研究设计了一种选择性的基因传递系统(简称HPT-PFS)，将CD47阻断和IL-12的产生相结合，以原位工程肿瘤细胞进行巨噬细胞介导的免疫治疗。该研究首先合成了氟化聚乙烯亚胺模块(简称PF)，与质粒络合形成核心层。最近的研究表明，氟化可以改善细胞摄取、聚合物/DNA多聚体的内体逃逸和细胞内DNA从聚合物中解离，从而产生高效的递送效率。然后，该研究引入透明质酸(HA)和肿瘤微环境敏感肽(TMSP)作为肿瘤选择性反应模块(HA-PEG-TMSP，简称HPT)，并将其包裹在核心层上，以提高肿瘤的靶向性和细胞内通路。TMSP是由基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)可裂解多肽接头(PVGLIG)连接的细胞穿透肽(CPP)和屏蔽肽组成，可被肿瘤部位过表达的MMPs选择性切割，从而暴露CPP促进细胞摄取。而在正常生理环境中，CPP被带负电荷的多肽屏蔽，保持惰性。

TMSP的使用可以克服CPPs的非选择性，因为大多数已知的CPPs在体外和体内几乎所有细胞类型中都不是细胞或组织特异性的，而是通过硫酸乙酰肝素和其他糖胺聚糖与细胞接触并被细胞内化。TMSP对纳米颗粒的修饰，无论是单独还是与靶向部分结合，都已被证明在肿瘤中具有良好的靶向性和酶响应性，并在此前的工作中增强了抗肿瘤作用。在这项研究中，该研究假设核壳结构纳米颗粒HPT-PFS在血液中循环时可以在亲水调理排斥PEG链的保护下保持稳定，通过HA介导的肿瘤靶向有效地定位和接近肿瘤细胞，而不是增强通透性和保留性(EPR)，并在MMPs裂解后暴露于CPP时促进细胞摄取。

释放的质粒从内吞体内逃逸后进入细胞核，表达Cas9/sgRNA复合物，产生IL-12，对肿瘤细胞进行重新编程。然后在sgRNA的指导下，Cas9在靶基因位点诱导双链断裂，导致CD47基因敲除。这些重新编程的过程使肿瘤细胞失去了“不要吃我”信号(CD47)的表达，成为IL-12的工厂。因此，CD47的阻断和IL-12的产生协同重新编程TAMs以诱导巨噬细胞介导的免疫治疗。

利用高精度的CRISPR/Cas9技术和精巧设计的基因递送系统HPT-PFS，该研究评估了基因递送效率、肿瘤特异性、基于CRISPR的CD47基因敲除和随后的吞噬作用以及IL-12的产生。此外，该研究还利用B16F10皮下肿瘤模型研究了CD47阻断联合IL-12产生的抗肿瘤作用及其免疫机制。

HPT-PFS纳米颗粒原位重编程肿瘤细胞诱导巨噬细胞介导免疫治疗的设计示意图（图片源自Nano Today ）

总而言之，HPT-PFS永久性地阻断了CD47/Sirpα的相互作用，并限制了这种作用在肿瘤细胞中的作用，克服了抗体和正常细胞之间相互作用引起的副作用。进一步结合肿瘤微环境调控策略，将肿瘤细胞转化为IL-12工厂，对免疫抑制因子TAMs进行重新编程，诱导巨噬细胞介导的抗肿瘤效应，为基于CRISPR的原位工程肿瘤细胞进行有效的免疫治疗铺平道路。

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