比较基因组分析助力大肠杆菌进化研究

近日，派森诺生物与福建医科大学附属协和医院李彬老师课题组合作，在微生物基因组领域的《Frontiers in Microbiology》发表研究成果！本研究针对大肠杆菌的遗传多样性和系统发育进行研究，揭示了大肠杆菌 ST1193 在中国福州和非中国地区传播的不同进化轨迹，进一步支持了在特定引入地理区域之后该谱系的全球传输和本地化谱系扩展。

研究背景

大肠杆菌(E.coli)是最常见的革兰氏阴性细菌性条件致病菌，它主要栖息于人类和其他温血动物的下肠道，在临床和流行病学方面都有极大的挑战。E.coli可导致多种临床感染，包括腹泻、无并发症的尿路感染和败血症等，每年导致全球超过200万人死亡。

在过去的 20 年中，由于E.coli产生超广谱β-内酰胺酶，对氟喹诺酮类和超广谱头孢菌素的耐药性迅速增加，而这种耐药性增加与特定克隆–ST131菌株在全球范围内的传播有关。有研究表明，E.coli ST131在耐氟喹诺酮类E.coli菌株中占近一半，有趣的是，E.coli种群结构是动态的。E.coli ST1193是一种新的序列类型，被报道为一种新兴的耐氟喹诺酮类 (FQ-R) 和有毒的大肠杆菌谱系。该类型菌株通常从动物和人类中分离出来，会导致各种肠外感染，如败血症、尿路感染和脑膜炎等。此外，该谱系的占比在 2010-2017 年期间从 4.4% 急剧上升至 22.2%，其增长频率比 ST131 谱系飙升了五倍，直到现在E.coli ST1193类型菌株成为继E.coli ST131-H30之后的第二个大克隆群。

近年来关于E.coli ST1193的流行病学的研究非常多，但是对这个谱系的进化过程和差异的了解较少。本研究旨在使用全基因组测序检测E.coli ST1193 谱系的菌株水平遗传多样性和系统发育，并在全球范围内深入了解该谱系，调查与抗菌素耐药性 (AMR) 相关的遗传元件的存在可能会给这种新兴细菌病原体带来选择性优势。

研究材料与方法

1、实验材料

本研究共计涉及76个 ST1193 菌株，其中51株是在中国福建医科大学协和医院分离得到的ST1193 类型菌株，25株从Enterobase数据库中下载。

2、测序平台

Illumina NovaSeq

3、分析内容

细菌框架图测序、耐药&毒力基因分析、核心基因组和辅助基因组分析、核心基因组Indel鉴定、药敏实验等。

研究结果

大肠杆菌 ST1193 的分子特征与系统发育分析
本研究共包括从中国福州和非中国地区的人类中收集的 76 个E.coli ST1193 类型，具有fimH64、filCH5和fumC14 等位基因，其中94.7% (72/76) 的E.coli ST1193 为O型O75。其余四个分离株无法分型。在这项研究中发现了两种类型的胶囊变体（K1 和 K5）,其中7株（9.33%）E.coli ST1193具有K5荚膜基因型，68株（90.67%）具有K1荚膜基因型。一个分离株既没有 K1 荚膜基因型，也没有 K5 荚膜基因型。具有K5荚膜的非中国大肠杆菌ST1193为16.67%（4/24），比例高于从中国福州采集的分离株（5.88%，3/51）。对76株菌进行CRISPR预测，并未发现任何一株菌具有潜在的CRISPR结构。

图1 76株菌的核心基因组系统发育树

基于检测到的 3,454 个单拷贝核心基因构建核心基因组系统发育树，结果显示所有E.coli ST1193 被分为两个进化枝（进化枝 A 和 B）：进化枝 A 包括 25 个非中国E.coli ST1193，进化枝B含有来自中国福州的所有分离株。同时，B分枝菌株比整个世界范围内的集合更加多样化。为了进一步探讨核心基因组进化树中不同分支的差异，比较基因组学结果表明，共在150个分支特异基因中发现了Indel，对这些特异基因进行GO富集分析发现超过70%的基因功能属于生物过程和分子功能中。除此之外，本研究对1134个辅助基因进行了附属基因组进化树构建，结果得到了7个不同的分支，将附属基因组簇与核心基因组进化树进行比较，结果发现附属基因组簇和核心基因组进化高度相似，揭示了从中国福州分离得到的51株E.coli ST1193型菌株具有较高的遗传多样性。

图2 GO富集分析

毒力基因分析
根据毒力基因(VF)分析发现，不同分离株间的VFs分布存在差异。70%的E.coli ST1193基因组具有毒力基因，如外膜血红素受体基因chuA（76/76, 100%）、铁载体受体基因fyuA（76/76, 100%）、菌毛蛋白基因yfcV（76 /76, 100%), 空泡自转运基因 vat (76/76, 100%), 分泌自转运基因 sat (72/76, 94.7%), IrgA 同源粘附素基因 iha (71/76, 93.4%), 谷氨酸酶基因 decar gad (70/76, 92.1%) 和质粒携带的肠毒素基因 senB (58/76, 76.3%)等，这些基因均可以在所有地理区域中检测到。值得注意的是，进化枝 A（非中国E.coli ST1193 分离株）和进化枝 B（来自中国福州的分离株）之间的 VF 存在显著差异，包括 cia、neuC、gad 和 traT。

图3 76株 E.coli ST1193型菌株毒力因子、质粒复制子类型和耐药基因热图

质粒复制子类型

对所有菌株进行质粒复制子类型分析，结果表明几乎所有的分离株（75/76，98.7%）都至少携带一种质粒复制子类型，其中包含19种一致的质粒不亲和类型。E.coli ST1193包含两种F型复制子(IncFIA和IncFIB)，而IncFII复制子仅在3株菌株中检测到。本研究基于质粒F等位基因进行质粒MLST分型，结果显示 IncFIA 等位基因 (A1) 在E.coli ST1193 中高度流行；IncFIB 等位基因是多样的，并且鉴定了 IncFIB 的四种不同等位基因（B-、B1、B10 和 B20）；Col (BS512) 和 Col156 在本研究中所有地理区域的分离株中高度流行。

图4 福州和非中国区分离株的毒力因子和质粒复制子类型比较

此外，进化枝 A（非中国大肠杆菌 ST1193 分离株）和进化枝 B（来自中国福州的分离株）之间携带的质粒复制子类型存在显著差异。IncQ1 在 60.9% 的非中国E.coli ST1193 中被鉴定，但仅在来自中国福州的 39.1% 分离株中被发现（p < 0.05）。Col156 在 84.0% 的非中国E.coli ST1193 中检测到，但在中国福州的分离株中仅发现 43.2%。IncB/O/K/Z 常见于来自中国福州的E.coli ST1193 (11/51, 21.6%)，在非中国分离株中未检测到 (0/25, 0%)。

抗生素抗性基因

在本研究中，所有E.coli ST1193型菌株的关键基因 parC (S80I)、parE (L416F) 和 gyrA (D87N 和 S83L) 中都包含相同的四个非同义突变，而这四个看家基因的突变会导致氟喹诺酮抗性。在76株E.coli ST1193菌株中均存在一些抗生素外排基因和与抗生素渗透性降低相关的基因，超过50%的分离株包含获得性耐药相关基因，如blaTEM-B（60.5%）、sul2（77.6%）、dfrA17(55.3%)等。而blaCTX-M-130 和 blaCTX-M-14仅在进化枝 A（非中国E.coli ST1193 分离株）中检测到，tet(B) 和 tet®仅在进化枝 B（来自福州、中国）检测到。此外，我们观察到进化枝 A 和进化枝 B 之间携带的 ARG 存在显著差异，包括 blaCTX-M-55、blaTEM-1、sul2、tet(B)、tet®、APH(6 )-Id 和 AAC(3)-IId等。

图5 福州和非中国区分离株的抗生素抗性基因比较

blaCTX-M-55 在E.coli ST1193 中具有不同的遗传环境
blaCTX-M-55 通常在E.coli ST1193 中发现，可能在 ST1193 谱系的克隆扩增中发挥重要作用，这促使我们进一步研究该基因在ST1193中的遗传环境。本研究在9个分离株中发现blaCTX-M-55基因，这些分离株均来自亚洲，其中 8 个来自中国福州，1 个来自泰国。从 blaCTX-M-55基因存在的质粒相关序列中，可以确定这些分离株和AMR基因相关。此外，发现 blaCTX-M-55和 IncI1 和/或FIB在 55.6% 分离株的同一contig中被鉴定出来。在所有9个分离株中，blaCTX-M-55位于 ORF477基因的下游。同时在blaCTX-M-55 的下游或上游检测到不同的移动元件，包括 ISEc9、Tn3 和整合酶基因；而blaTEM-1位于中国福州的两个分离株中 blaCTX-M-55的上游。

图6 E.coli ST1193 中 blaCTX-M-55 的遗传环境

研究结论

本研究为耐氟喹诺酮类药E.coli ST1193菌株系统发育关系提供了重要依据。研究结果表明，E.coli ST1193在中国福州和非中国地区的传播轨迹不同，其中中国福州分离株似乎比整个全球范围内的更加多样化。本结果是一个很好的引航分析，可以为进一步扩展分析提供一个起点。应进行战略性和持续性监测，以防止E.coli ST1193 引起的感染。

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