全外显子捕获测序的杂交和封闭原理

做外显子捕获测序实验时，会用到Cot DNA，blocker(封闭接头序列)，探针（DNA/RNA均可），链霉素磁珠等，它们具体起什么作用呢？下面，我们就来聊聊这个问题。

就实验原理来讲，外显子捕获测序的基本流程是：1.先对各个样品独立构建常规测序文库；2：等摩尔比例混合各个待杂交的文库；3：在杂交缓冲液体系内加入文库、杂交探针、Cot DNA、Blocker等；4.加入链霉素磁珠抓取杂交复合状态DNA；5：在洗脱缓冲液中洗脱目标文库，并扩增。
下图是正常建好的文库示意图。

大家都知道，DNA是双链互补配对的。当加热打开DNA双链变性为单链DNA之后，慢慢降低温度，单链DNA会根据互补配对原则自然还原回双链状态（也就是退火过程）。那么，可以想象一下，当很多不同的DNA文库混合在一起的时候，进行退火操作，可能会产生什么样子的DNA结合状态呢？下图说明了其中可能存在的3种情况。

由上图可知，不论哪种状态，都不可能捕获到目标DNA。其实，情况2、3的杂交状中，P5或者P7端还可以杂交第三个、第四个等等分子。

所以，加入Blocker就是为了阻止P5、P7端的杂交，从而阻止非特异性杂交。Cot DNA则是为了阻止原来互补配对的单链杂交回来。带Biotin修饰的探针是为了杂交靶序列，链霉素磁珠是为了吸附Biotin修饰的杂交复合物。

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