一、将16S 数据导入QIIME 2
1. 生成原始数据的file path文件
该文件包含首行、每个样本的 ID、rawreads文件路径、forward或reverse信息。
首行必须是:sample-id,absolute-filepath,direction

文件格式示例:


2. 导入QIIME2
输入:路径文件
输出:demux-summary.qza

单端数据使用命令:

qiime tools import --type 'SampleData[SequencesWithQuality]'  --input-path input-path-list.tsv --output-path single-end-demux.qza  --input-format SingleEndFastqManifestPhred33 
1
双端数据使用命令:

qiime tools import --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' --input-path input-path-list.tsv --output-path demux-summary.qza --input-format PairedEndFastqManifestPhred33 
1
生成qzv可视化文件查看数据质量:

qiime demux summarize --i-data demux-summary.qza --o-visualization demux-summary.qzv 
1
二、降噪(Denoise)流程
这里罗列Deblur与Dada2两种方式,实际应用可以二选一。据说dada2速度更快,而且,我自己的实验测试表明 dada2 更加准确。

这些降噪方法滤除有噪声的序列,校正边缘序列中的错误(仅在 Dada 2 的分析中)、去除嵌合序列、去除偶然序列(singletons,即:出现频率仅有一次的序列)、合并去噪后的双端序列(仅在Dada 2 的分析中),然后对这些序列进行去冗余。

1. Deblur 流程
(1)先使用QIIME 2的 vsearch 接口做join pairs
根据两端序列末端的互补配对,可以合并为我们扩增区域的序列,同时还可以对重叠区的质量进行校正,保留最高测序质量的碱基结果。

qiime vsearch join-pairs --i-demultiplexed-seqs demux-summary.qza --o-joined-sequences joined.qza 
1
生成可视化文件,查看其join后的长度及质量。

qiime demux summarize --i-data joined.qza --o-visualization joined.qzv
1
(2)按测序碱基质量过滤序列
输入:拼接后的qza文件

输出:
demux-filtered.qza:序列质量过滤后结果。
demux-filter-stats.qza:序列质量过滤后结果统计。

单端数据使用命令:

qiime quality-filter q-score --i-demux demux.qza --o-filtered-sequences demux-filtered.qza --o-filter-stats demux-filter-stats.qza
1
双端数据使用命令:

qiime quality-filter q-score-joined --i-demux joined.qza --o-filtered-sequences joined-filtered.qza --o-filter-stats joined-filtered-stats.qza
1
分别生成可视化qzv文件:

joined-filtered.qzv

qiime demux summarize --i-data joined-filtered.qza --o-visualization joined-filtered.qzv 
1
joined-filtered-stats.qzv

qiime metadata tabulate --m-input-file joined-filtered-stats.qza --o-visualization joined-filtered-stats.qzv
1
joined-filtered-stats.qzv示例图

(3)降噪
自设参数解释:
–p-trim-length: 通常,Deblur开发人员建议将该值设置为质量分数中位数开始下降至低质量区时的长度。

输入:拼接过滤后的qza文件

输出:
deblur-stats.qza: 过程统计
table-deblur.qza: 特征表
rep-seqs.qza: 代表序列

使用命令示例:

qiime deblur denoise-16S --i-demultiplexed-seqs joined-filtered.qza --p-trim-length 250 --o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-table table.qza --p-sample-stats --o-stats deblur-stats.qza 
1
分别生成可视化qzv文件:

过程统计表:
qiime deblur visualize-stats --i-deblur-stats deblur-stats.qza --o-visualization deblur-stats.qzv 
1
feature table:
特征表汇总(可视化)命令 feature-table summarize ,提供每个样品和每个特性相关联的序列数量、这些分布的直方图以及一些相关的汇总统计数据信息。

qiime feature-table summarize --i-table table.qza --o-visualization table.qzv --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv 
1
代表序列:
feature-table tabulate-seqs 命令提供特征ID到序列的映射,提供链接以针对NCBI nt 数据库 BLAST 每个序列。

qiime feature-table tabulate-seqs --i-data rep-seqs.qza --o-visualization rep-seqs.qzv 
1
2. Dada 2 流程
(1)降噪
双端序列处理,自设参数解释:
–p-trim-left-f 0 :表示从forward左端的第0位置开始
–p-trim-left-r 0: 表示从reverse左端的第0位置开始
–p-trunc-len-f 250 :表示forward总共保留的长度为250
–p-trunc-len-r 250:表示reverse总共保留的长度为250

输入:导入QIIME 2的 rawreads

输出:
stats-dada2.qza: 过程统计
table-dada2.qza: 特征表
rep-seqs-dada2.qza: 代表序列

单端数据命令示例:

qiime dada2 denoise-single --i-demultiplexed-seqs demux-summary.qza --p-trim-left 0 --p-trunc-len 120 --o-representative-sequences rep-seqs-dada2.qza --o-table table.qza --o-denoising-stats dada2-stats.qza 
1
双端数据命令示例:

qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs demux-summary.qza --o-table table.qza --o-representative-sequences rep-seqs-dada2.qza --o-denoising-stats dada2-stats.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 250 --p-trunc-len-r 250 
1
生成可视化qzv文件:

qiime metadata tabulate --m-input-file dada2-stats.qza --o-visualization dada2-stats.qzv 
1
3. table.qza(拓展内容)
QIIME 2 的产物 qza 后缀文件相当于一个压缩包,可以使用 “ unzip ”命令解压。
特征表文件 feature_table.qza 或 table.qza 文件解压后,在 data/ 目录下会获得一个后缀为.biom的文件,将其转换为 tsv 文件的命令是:

biom convert -i feature-table-class.qza -o table.tsv --to-tsv 
1
三、过滤feature table
1. 按代表序列数量过滤
保留总测序量大于3条的代表序列:

time qiime feature-table filter-features \ --i-table table.qza \ --p-min-frequency 3 \ --o-filtered-table feature-frequency-filtered-table.qza 
1
2. 偶然因素过滤
为了规避偶然因素,保留至少在2个样品本存在的ASV :

time qiime feature-table filter-features \ --i-table table.qza \ --p-min-samples 2 \ --o-filtered-table sample-contingency-filtered-table.qza 
1
3. 过滤序列
根据功能的分类注释过滤代表序列。
qiime taxa filter-seqs 提供的该功能与 qiime taxa filter-table 中提供的功能非常相似,因此可以参考QIIME 2对 qiime taxa filter-table 的描述,以了解有关基于分类筛选的更多信息。
简单地说,filter-seqs可以保留包含门级注释的所有特征,但在其分类注释中排除包含线粒体或叶绿体的所有特征对应的序列。

qiime taxa filter-seqs \ --i-sequences sequences.qza \ --i-taxonomy taxonomy.qza \ --p-include p__ \ --p-exclude mitochondria,chloroplast \ --o-filtered-sequences sequences-with-phyla-no-mitochondria-no-chloroplast.qza 
1
补充:
想要了解更多,另请参见q2-quality-control插件

四、各个OTU的代表序列及系统发育树的构建
1. 为Alpha多样性分析提供系统发育树
自设参数解释:
–output-dir:将文件都输出到该目录下

输入:代表序列

输出:
aligned-rep-seqs.qza: 多序列比对结果
masked-aligned-rep-seqs.qza: 过滤去除高变区后的多序列比对结果
rooted-tree.qza: 有根树,用于多样性分析
unrooted-tree.qza: 无根树

命令示例(指定了一个输出目录):

qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --p-n-threads 0 --output-dir masked-aligned-rep-aligned
1
或者分多步生成输出文件:

qiime alignment mafft --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza

qiime alignment mask --i-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza

qiime phylogeny fasttree --i-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza

qiime phylogeny midpoint-root --i-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza 
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2. 导出上一步生成的进化树
可以导出上一步生成的进化树,用于其它软件分析:

qiime tools export --input-path unrooted-tree.qza --output-path exported-tree 
1
导出结果为 exported-tree/tree.nwk 是标准树nwk文件。

五、多样性分析
1. 多样性指数介绍
(1) Alpha多样性指数:
丰富度指数:
Richness, Chao1,Shannon三个指数是常用的评估丰富度的指标,数值越高表明样品包含的物种丰富度就越高。
Richness指数: 指样本中被检测到的OTU量;
Chao1指数 : 通过低丰度OTUs来进一步预测样品中的OTUs数量;
Shannon指数 : 计算考虑到样品中的OTUs及其相对丰度信息,通过对数(如以2为底的shannon_2,以自然对数为底的shannon_e以10为底的shannon_10)转换来预测样品中的分类多样性。

均匀度指数:
Simpson,Dominance和Equitability三个指数是常用的评估均匀度的指标。
Simpson指数:表示随机选取两条序列属于同一个分类(如OTUs)的概率(故数值在0~1之间),数值越接近1表示表明OTUs的丰度分部越不均匀;
Dominancez指数 : 取值为1-Simpson,表示随机选取两条序列属于不同分类(如OTUs)的概率;
Equitability指数:根据Shannon指数值计算,当其值为1时表明样品中的物种丰度分布绝对均匀,而其值越小这表明物种丰度分布呈现出越高的偏向。

(2) Beta 多样性指数
Jaccard距离(群落差异的定性度量,即只考虑种类,不考虑丰度)
Bray-Curtis距离(群落差异的定量度量)
非加权UniFrac距离(包含特征之间的系统发育关系的群落差异定性度量)
加权UniFrac距离(包含特征之间的系统发育关系的群落差异定量度量)
2. QIIME 2 计算多样性指数(拓展内容)
QIIME 2 数据分析流程通过 qiime diversity 接口提供了分析 Alpha 多样性的各种命令,使用以下命令可以针对性地生成所选的多样性指数文件:

参数解释:
–i-table : FeatureTable --p-metric : 选择一种方式,如下:

enspie|michaelis_menten_fit | strong | lladser_pe | fisher_alpha
| goods_coverage | doubles | simpson | margalef | observed_otus | osd
| shannon | pielou_e | chao1 | brillouin_d | menhinick | simpson_e
| kempton_taylor_q | robbins | dominance | lladser_ci|heip_e
| singles | chao1_ci | mcintosh_d | ace | mcintosh_e | gini_index
| berger_parker_d | esty_ci

–o-alpha-diversity: 输出alpha多样性
–output-dir: 输出目录(如果不指定 --o-distance-matrix)

命令执行示例:

qiime diversity alpha --i-table table.qza --p-metric goods_coverage --o-alpha-diversity goods_coverage.qza
qiime diversity alpha --i-table table.qza --p-metric goods_coverage --o-alpha-diversity goods_coverage.qza 
1
2
3. 计算核心多样性(无树的情况)
根据该命令,可以批量生成上一步骤的多样性指数文件。

qiime diversity core-metrics --i-table table.qza --p-sampling-depth xxx --m-metadata-file metadata.tsv --output-dir outdir
1
输出:
rarefied-table
observed-otus-vector
shannon-vector
evenness-vector
jaccard-distance-matrix
jaccard-pcoa-results
jaccard-emperor
bray-curtis-distance-matrix
bray-curtis-pcoa-results
bray-curtis-emperor

4. 计算核心多样性(系统发育树)
参数解释:
–m-metadata-file:元数据文件
–p-sampling-depth:它是指定重采样(即稀疏/稀释)深度。这个脚本将随机地将每个样本的测序量重新采样至该参数提供的值。它将对每个样本中的计数进行无放回抽样,从而使得结果表中的每个样本的总计数为指定值。如果任何样本的总计数小于该值,那么这些样本将从多样性分析中删除。通过查看上面创建的表table.qzv文件中呈现的信息并选择一个尽可能高的值(因此每个样本保留更多的序列)同时尽可能少地排除样本来进行选择。

命令示例:

qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table table.qza --p-sampling-depth 9020 --m-metadata-file sample-metadata.tsv --output-dir core-metrics-results 
1
输出(qza 文件):

(1) faith_pd_vector.qza:“Alpha 多样性考虑进化的faith指数” 谱系阿尔法多样性;
(2) unweighted_unifrac_distance_matrix.qza:无权重 unifrac 距离矩阵;
(3) bray_curtis_pcoa_results.qza:基于 Bray-Curtis 距离 PCoA 的结果 ;
(4) shannon_vector.qza:Alpha 多样性香农指数
(5) rarefied_table.qza:抽样后的特征表;
(6) weighted_unifrac_distance_matrix.qza:有权重的 unifrac 距离矩阵;
(7) jaccard_pcoa_results.qza:jaccard 的距离 PCoA 结果 ;
(8) observed_otus_vector.qza:Alpha 多样性 observed otus指数;
(9) weighted_unifrac_pcoa_results.qza:基于有权重的unifrac距离的 PCoA 结果;
(10) jaccard_distance_matrix.qza:jaccard 距离矩阵;
(11) evenness_vector.qza:Alpha 多样性均匀度指数;
(12) bray_curtis_distance_matrix.qza:Bray-Curtis 距离矩阵;
(13) unweighted_unifrac_pcoa_results.qza:无权重的 unifrac 距离的 PCoA 结果。

输出(qzv 可视化文件):

(14) unweighted_unifrac_emperor.qzv:无权重的 unifrac 距离的 PCoA 结果采用 emperor 可视化;
(15) jaccard_emperor.qzv:jaccard 距离 PCoA 结果采用 emperor 可视化;
(16) bray_curtis_emperor.qzv:Bray-Curtis 距离 PCoA 结果采用 emperor 可视化;
(17) weighted_unifrac_emperor.qzv:有权重的 unifrac 距离 PCoA 结果采用 emperor 可视化。

unweighted unifrac PCOA 结果可视化示例图

5. Alpha多样性分析结果可视化和组间显著性分析
命令示例:

qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity evenness_vector.qza --m-metadata-file sample-metadata.tsv --o-visualization evenness-group-significance.qzv 
1
evenness-group-significance.qzv 示例

6. Beta多样性分析结果可视化和组间显著性分析
输入是距离矩阵

qiime diversity beta-group-significance --i-distance-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza --m-metadata-file sample-metadata.tsv --m-metadata-column SpecimenType --o-visualization unweighted-unifrac-significance.qzv --p-pairwise 
1
unweighted-unifrac-significance.qzv 示例

7. QIIME 2 的抽样方法(拓展内容)
QIIME默认的抽样方法是从第10个OUT代表序列开始,到第38895个OUT代表序列截止,其间抽样10次,每次增加3888条序列。因为每个样本总体中物种的序列是随机分布的,而且样本容量是从小到大逐步增加,所以在解读结果时一定要清楚以下几点:

有可能样本总体中靠前的序列shannon指数和simpson指数均高于平均值,那么在图上会出现先下降再到平台区的曲线。
各样本中OTU数不同,而随机抽样时有可能有些样品的总量达不到38895,因此在网页结果的表格中会有nan(即Not a Number)表示缺损,同时反映在图上是每个样品的曲线终点并不同一x轴位置。
用样本总体算出来的多样性指数和这种抽样算出来的曲线终点位置有出入,只是位置接近,并不相等,这很正常。rarefaction曲线的意义是反应一种变化情况,其终点位置仅供参考。因为有些样本OUT代表序列多于38895,有些少于38895,而如果用所有序列计算得到的只是最后的一个值。
8. 阿尔法稀疏曲线:
阿尔法稀疏曲线(Alpha rarefaction curve) 主要用于检测测序量是否充足。

参数解释:
–p-max-depth:重采样深度

输入:feature table

输出:alpha-rarefaction.qza.qzv

命令示例:

qiime diversity alpha-rarefaction --i-table table.qza --p-max-depth 9020 --o-visualization alpha-rarefaction.qza --p-metrics simpson --p-metrics observed_otus --p-metrics shannon
1
shannon稀疏曲线示例

按元数据文件分组(如果想看到所有样本,去掉–m-metadata-file即可):

输入:feature table、系统发育树

qiime diversity alpha-rarefaction --i-table table.qza --i-phylogeny rooted-tree.qza --p-max-depth 9020 --m-metadata-file sample-metadata.tsv --o-visualization alpha-rarefaction_2.qzv 
1
注:
如果稀疏曲线延x轴趋于平缓,则代表观察到了样品的丰富程度,收集超出该采样深度的其它序列不太可能得到新的多样性。上方图中的方框图代表了每组样本在每一个均匀采样深度上所选择的alpha多样性度量的分布。其下方图的折线图显示了每组样本的数量(即:为每个盒状图的样本量)。

六、物种组成分析
1. 下载 / 训练 物种注释分类器
分类器下载:

wget \ -O "gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza" \ "https://data.qiime2.org/2019.4/common/gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza" 
1
可能会由于网络原因下载失败。
可以使用自己训练物种分类器,训练方法如下所述:

(1) 准备文件:
该教程数据为85%相似度的参考数据。(即:以85%相似度为阈值,序列及其注释到的物种。)
参考教程:https://docs.qiime2.org/2020.6/tutorials/feature-classifier/

参考OTU数据集(训练用)

wget -O "85_otus.fasta" "https://data.qiime2.org/2020.6/tutorials/training-feature-classifiers/85_otus.fasta"
1
参考数据集的物种分类信息(训练用)

wget -O "85_otu_taxonomy.txt" "https://data.qiime2.org/2020.6/tutorials/training-feature-classifiers/85_otu_taxonomy.txt"
1
代表序列文件(rep-seqs.qza)(测试用)

wget -O "rep-seqs.qza" "https://data.qiime2.org/2020.6/tutorials/training-feature-classifiers/rep-seqs.qza"
1
(2) 训练分类器
接下来,我们将这些数据导入到 QIIME 2 对象中。

由于默认源格式需要标题,而 Greengenes 序列物种注释文件(85_otu_Taxonomy.txt)是一个不带标题的制表符分隔文件,因此必须指定 HeaderlessTSVTaxonomyFormat 作为源格式。

导入上述参考OTU数据集:
qiime tools import --type 'FeatureData[Sequence]' --input-path 85_otus.fasta --output-path 85_otus.qza
1
导入物种分类信息文件:
qiime tools import --type 'FeatureData[Taxonomy]' --input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat --input-path 85_otu_taxonomy.txt --output-path ref-taxonomy.qza
1
根据barcode截取序列片段:(也可以不截取,直接测全长)
( 根据需要截取的扩增区域片段设置 --p-f-primer 和 --p-r-primer )

命令示例:
V4:

qiime feature-classifier extract-reads \
  --i-sequences 85_otus.qza \
  --p-f-primer GTGCCAGCMGCCGCGGTAA \
  --p-r-primer GGACTACHVGGGTWTCTAAT \
  --p-trunc-len 100 \
  --o-reads ref-seqs.qza
1
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6
V3-V4:

qiime feature-classifier extract-reads \
  --i-sequences 85_otus.qza \
  --p-f-primer ACTCCTACGGGAGGCAGC \
  --p-r-primer GGACTACHVGGGTWTCTAAT \
  --p-trunc-len 100 \
  --o-reads ref-seqs.qza
1
2
3
4
5
6
获得分类器
我们将使用下面的命令训练Naive Bayes分类器,基于筛选的指定区段,生成实验特异的分类集。

生成分类器文件:classifier.qza

qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
  --i-reference-reads ref-seqs.qza \
  --i-reference-taxonomy ref-taxonomy.qza \
  --o-classifier classifier.qza
1
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3
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2. 物种注释和可视化
QIIME 2中的物种分类器有以下几种:

朴素贝叶斯机器学习分类器;
基于Vsearch和BLAST+的基于比对的分类一致性方法。
注: Qiime2默认置信度阈值:0.7( --p-confidence )

这里描述机器学习法的分类器使用方式,使用训练后的分类器对结果进行注释,这种分类方法受到【用来训练分类器的参考数据的正确性】的影响很大,因此虽然是种广受推崇的新式方法,但也可能出现结果错误的情况。

输入:
classifier.qza:分类器
rep-seqs.qza:代表序列

输出:
taxonomy.qza: 物种注释结果
classifier.qza: 分类器的训练结果

qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza 
1
生成可视化qzv文件:

qiime metadata tabulate --m-input-file taxonomy.qza --o-visualization taxonomy.qzv
1
物种注释可视化结果示例

获取物种注释 + 对应的序列数 :

qiime taxa collapse --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy-dada2.qza --p-level 7 --o-collapsed-table feature-table-class.qza 
1
输出结果的 qza 解压后为 biom 文件,需要转换为 tsv 文件来查看。

biom convert -i feature-table-class.qza -o table.tsv --to-tsv 
1
3. 物种注释的堆叠柱状图
用交互式条形图查看样本的分类组成,使用以下命令绘图成堆叠柱状图:

输入:feature table、物种注释结果、元数据文件
输出:堆叠柱状图

命令示例

qiime taxa barplot --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file sample-metadata.tsv --o-visualization taxa-bar-plots.qzv 
1
可视化结果示例:

图文含义:
如图为门级别的物种注释结果,以堆叠柱状图的形式展示出。
不同颜色的柱体代表不同菌门在各样本中的丰度占比(y轴丰度比不进行叠加)

4. 差异分类学级别分析:以按门水平合并再统计差异(拓展内容)
我们也经常对在特定的分类学层次上执行差异丰度检验。为此,可以在感兴趣的分类级别上折叠FeatureTable[Frequency]中的特性,然后重新运行上述步骤。在下述实例中,我们将特征表折叠到属级别(即Greengenes分类法的第6级)。按门水平进行合并,统计各门的总reads

(1) 生成对应级别的特征表
输入:特征表、物种注释结果

参数解释:
-p:选择折叠级别

输出:对应级别的特征表

命令示例:

qiime taxa collapse --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-level 2 --o-collapsed-table table-l2.qza 
1
(2) 去除零生成组成型特征表
qiime composition add-pseudocount --i-table table-l2.qza --o-composition-table comp-table-l2.qza
1
(3) 在门水平按取样部分分析
qiime composition ancom --i-table comp-table-l2.qza --m-metadata-file sample-metadata.tsv --m-metadata-column BodySite --o-visualization l2-ancom-BodySite.qzv
1
5. 合并feature count与taxonomy information (拓展内容)
按照taxonomy将feature分组,生成一个新的 feature table,feature ids 即为物种注释的标签。

qiime taxa collapse --i-table feature-table-2.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-level 3 --o-collapsed-table 
————————————————
版权声明:本文为CSDN博主「砂之家Kora」的原创文章,遵循CC 4.0 BY-SA版权协议,转载请附上原文出处链接及本声明。
原文链接:https://blog.csdn.net/weixin_42126262/article/details/107285753

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