时间：2020-6-16

单位：巴西路德大学

期刊：Tuberculosis (结核病专业杂志, IF: 3.13)

链接：https://doi.org/10.1016/j.tube.2020.102015

题目：在巴西南部发现一株对利福平具有高度耐药性的结核分枝杆菌

前 言

结核病 (Tuberculosis, TB)仍然是世界范围内的重大突发公共卫生事件，目前控制该疾病的努力受到耐药结核病 (Drug-resistant TB, DR-TB)病例高比率的威胁。结核病治疗的总体成功率为82%，但多重耐药 (Multidrug resistance-TB, MDR-TB)，即对两种主要抗结核药物异烟肼 (INH)和利福平 (Rifampicin, RIF)的耐药性，与较差的治疗结果有关，使治愈率降至60%。RIF具有很强的杀菌作用，是抗结核治疗中最重要的药物之一。

RIF的作用机制为与rpoB基因编码的RNA聚合酶 (RNAp)的β亚基结合，从而抑制细菌mRNA转录。结核分枝杆菌对RIF耐药的发生一般与rpoB基因的单核苷酸替换有关，主要位于利福平耐药决定区 (Rifampicin resistance determining region, RRDR)，是一个81bp的区域。

在巴西南部的南里奥格兰德州研究发现，在耐多药结核分枝杆菌rpoB基因的435密码子处插入12个核苷酸 (nt)，导致了4个氨基酸 (Q-N-N-P)重复，这种插入在世界上任何其他地区都没有报道。因此，为了加强巴西南部结核病控制管理，需要阐明12nt插入的分子和表型后果，以及对这种菌株传播到人群的理解。对于这一建议，基于WGS的研究方法筛选了南里奥格兰德州的耐RIF结核分枝杆菌菌株，以确定携带12nt插入的菌株。本文研究了这些菌株之间的系统进化 (Phylogenetic)关系，插入突变在抗性水平和生物学成本 (Biological cost)上的表型后果，以及对RIF结合效应的影响的计算机预测。

结 果

人群与表型耐药性

在南里奥格兰德州的174株耐RIF菌株中，有16株 (9.19%)在rpoB基因第435位密码子上进行了12nt插入，均为多重耐药株。根据药敏试验 (DST)结果，在这16株MDR菌株中，一株对乙胺丁醇 (EMB)额外耐药，另一株对链霉素 (STR)额外耐药。其中9人是囚犯，或在监狱里呆过一段时间，2人无家可归。这些囚犯来自4个不同的监狱机构。(文章结尾：12nt插入株有可能从监狱服刑人群传播到社区)

RpoB基因12nt插入的分子特征

通过分析rpoB基因的核苷酸序列，发现12nt插入的发生情况略有不同。总体而言，12nt插入发生在对应于rpoB基因第435密码子的基因组位置761111。然而，在16株插入该基因的菌株中，有12株在761110位由腺嘌呤变为鸟嘌呤，导致第435位氨基酸发生替换 (GAC>GGC，Asp435Gly)。为了便于理解，将基因组位置761110处具有额外多态性的12个核苷酸插入命名为“rpoB INS1” (12/16)，而将仅有12个nt插入命名为“rpoB INS2” (4/16)。此外，对两株同时携带rpoB INS1和rpoB INS2的菌株 (混合菌株)进行了Sanger测序，发现与基于NGS的测序没有差异。为了了解这种插入在全球其他菌株中可能发生的情况，基于在线工具TBDreaMDB、MUBII-TB-DB、ReSeqTB中的可用数据进行了审查，结果没有发现这种变异。

显示12个核苷酸插入的发生情况，INS1, INS2

遗传多样性与系统进化分析

根据SNP分型 (SNP-based typing)，所有出现12nt插入的菌株均属于结核分枝杆菌第4亚型，4.3.3亚型，属于欧美系 (LAM RD115 sublineage)。同样，所有菌株都带有RD115缺失。在计算机分型 (In silico spoligotyping)中，有15株菌株具有相同的Spoligo型，属于Spoligo国际型 (SIT)，以前被错误地鉴定为Mycobacterium pinnipedii。其余菌株在重复序列 (Direct repeat, DR)位点上缺失43个间隔 (Spacers)，在SITVIT2数据库中被归类为ATYPIC (SIT 2669)。

此外，包括7个结核分枝杆菌谱系、4个亚系和其他4个不含12nt插入的SIT863菌株的基因组的系统进化推断表明，12nt插入的菌株与其他SIT863菌株 (下图浅绿色背景)的亲缘关系很近。基于WGS的系统进化分析揭示的另一个重要事实是，以5个SNPs为阈值，这16个菌株被聚为一个独特的基因组簇。

16株携带12nt插入的菌株，4株未插入的SIT863菌株，以及来自主要谱系和4个亚系的进化树。

基于goeBURST算法的12nt插入和不带插入应变的SIT863的最小生成树

在耐药相关基因突变方面，16株菌株均存在katG基因Ser315Thr突变，其中3株存在与乙胺丁醇 (EMB)耐药相关的变异：1株为embA基因 (−11C>A)，1株为embB基因 (Met306Val)，1株为embB基因双突变 (Gly406Asp和Met306Ile)。此外，1株显示出与乙硫酰胺抗性相关的突变(ethA基因755/756密码子的插入)。

计算机预测药物结合效应

本研究模拟了INS1和INS2对RNAP结构的影响，以预测这些多态性对RIF和聚合酶之间相互作用的影响。首先先进行同源建模，随着同源模型的验证，使用对接程序 (Docking programs)来预测模型结构中的RIF相互作用。在表1中，可以观察到，与RNAP_INS1-RIF相互作用和RNAP_INS2-RIF相互作用的平均值相比，对接到RNAP_wt-RIF结合位点指示了对RNAP_wt-RIF相互作用的更大的亲和力。

RNAP_wt(浅蓝)、RNAP_INS1(红色)和RNAP_INS2(藏青蓝)结构的拟合示意图

抗性水平与生物代价

9株携带12nt插入的临床分离株的MIC值为≥32 mg/L，分别测定了2株12nt插入的临床分离株 (GI=38.5h)、3株野生型临床分离株 (GI=20h)和1株敏感对照株(H37Rv) (GI=15h)的平均生长指数。插入株的生长速度比野生型和H37Rv株分别慢1.95和2.5倍，表现出适应性劣势。

结 果

本研究描述了近年来在巴西南部出现的一种结核分枝杆菌菌株的关键分子和表型特征，该菌株在rpoB基因上有一个罕见的12nt插入突变，导致了高水平的RIF耐药。系统发生学方法 (系统进化分析)表明，12nt插入株有可能从监狱服刑人员传播到社区，这表明有必要加强对服刑人员中结核病传播的监测，以及该地区抗结核治疗的工作，特别是MDR株。由于对RIF的高度抗药性及其已确定的持续性传播，监测这种毒株在人群中的传播至关重要。有必要对这种描述的菌株进行更快速、更实时的监测，以切断其传播。对于这一建议，有必要进行基于PCR的快速检测，快速、简便和低成本地鉴定该菌株。

聊生信复现

从头分析获得的VCF文件中记录的变异 (服从NGS左移原则，变异位置：761110)

灰色：利福平；浅蓝：野生；红色：INS1；紫色：INS2

(聊生信)

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