今天我们继续来聊一聊ImageJ的高阶使用技巧。

问题三、为什么总是全部圈起来的灰度值，有没有大神指导呢求助！

本问题涉及免疫印迹(Western Blot)分析，提问者不能分别得到每个条带的值。

灰度值0为纯黑，255为纯白，灰度值与光密度值(OD值)的关系如下图所示：

以灰度来统计WB条带的话，无条带的纯白255左右，条带越黑着色越深灰度值反而越小，这与我们的认知不符。

步骤：

1. File -> Open -> 打开需要分析的WB条带。

2. Image –> Type -> 8-bit, 将图像转换为8-bit的灰度图片；Image-> Invert，黑白反转，得到如下图片：

3. Analyze -> Calibrate, 校正光密度值Function中选择Uncalibrated OD，左下方Global calibration，勾选表示有多张图片打开时对所有图片进行此操作。否则只对当前图片进行此操作。

4. 在工具栏中选择矩形工具——Rectangular, 最左边的为矩形工具，选择条带：

键盘上按数字1，弹出如下提示框：

点Yes，键盘上按数字3，得到如下：

5.工具栏中选择直线工具——Straight，下图最右边的为直线工具，按住Shift键使用直线工具画竖线将步骤4的峰进行分割：

6.选择魔棒工具——Wand tool，分别点击分割好的峰，即可得到结果，保存结果(File -> Save as…)即可：

7. WB统计分析一般将对照组标准化为100%或1，上述结果6个条带前3个为对照组。在Excel中，先计算对照组3个的平均值(AVERAGE(B2:B4))：

然后所有B列的数值除以对照组平均值，此时对照组的均值为1：

8. 将所得数据放入Graphpad prism绘图即可：

拓展：

弯曲的WB条带应如何使用ImageJ拉直？

1. 使用Segmented line沿着倾斜条带画间断线段：

2.双击Segmented line，设置线段的宽度至包含所有条带：

3. 点击菜单栏Edit-> Selection-> Straighten，倾斜的WB条带即可拉直：

问题四、如何统计SEM图片小球数量？

步骤：

1. 打开ImageJ软件，File-> Open打开SEM图片。Image-> Type将图片调整为8-bit。

2. Process-> Enhance Contrast，选择Normalize，点击OK：

3. Process-> Find Maxiam，根据Preview point selection查看Noise tolerance参数的效果，Output type 选择Count可得到计数数据：

得到结果共有343个小球：

问题五、怎样用image J一键输出这张图上所有的叶片面积，并且是编号的？

步骤：

1. ImageJ软件打开叶子图片，Image Type将图片调整为8-bit。

2. Image -> Adjust -> Threshold 调节阈值，红色代表选中，使所有叶子均被选中，叶子阈值为0-123。

3. 使用魔棒选中一片看起来最小的叶子，以此来评估叶子的大小范围。Analyze ->Measure进行测量：

4. Analyze -> Analyze particles。

Size(pixel^2): 默认为0-Infinity(无穷大)，意思是需要计算的细胞数的细胞大小在哪个区间，比如在此叶子大小选择为 20000-Infinity，将不是计数目标的杂质点过滤掉，在此我们需要根据目的细胞的大小来试几个最小值就能得到准确的细胞计数结果。

点击OK，得到每片叶子的编号、轮廓与面积：

拓展1：

上述得到的Area单位为pixel^2，如何得到其实际面积？

在未校准标尺的情况下，ImageJ打开的图片为像素(px)，标尺反应的是图片像素与实际长度的比例关系：

叶子的照片需要在拍照时放置一个已知长度的尺子——标尺。

ImageJ添加标尺步骤如下：

1.ImageJ软件打开含有标尺的叶子图片：

2. 使用直线工具按住Shift沿着标尺画一条直线：

3. Analyze->Set Scale：

直线的距离为31pixels，在Known distance(已知距离)填入1cm，Unit of length为cm，Global对所有后续打开图片有效，否则只对当前图片有效，点击OK。此时叶子图片标尺为：

4. 后续分析叶子面积与前述步骤一致，此时得到的面积单位为cm^2：

拓展2：

如何得到一组叶子的平均面积、标准差信息？

在得到同一图片内数张叶子面积后，Results->Distribution，选择Area：

得到分布结果：

总共有5个面积，Mean为2.928，StdDev为1.574，Min为0.938，最大值为4.655……。

当然，Results->Summarize也可以得到上述信息：

今天给大家分享ImageJ的使用就到此为止，希望对大家有所帮助！