MCE | 打破 Western Blot 玄学操作
看我一顿操作猛如虎:
电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵一抗 → 孵二抗 → 检测,剩下的就是等待。
图 1. Western blot 操作流程简介[1]
我的实验结果中出现了各种稀奇古怪的玩意儿???
■ 古怪一:高背景
萌 Cece 分析:
1、洗涤不充分,膜没有洗干净。
2、封闭不充分,一抗可能直接结合到膜上,造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。
3、一抗/二抗浓度太高,出现非特异性结合。
措施:
1、对于洗涤不充分,可适当增加洗涤次数和时间,也可尝试提高洗涤液中 Tween-20 的含量 (如提高至 0.5-1%) 。
2、要解决封闭不充分这个问题,可尝试延长封闭时间,也可更换封闭液。常用的封闭剂有 5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等,推荐室温封闭 1 小时以减少背景。另外,脱脂奶粉常含有酪蛋白,由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此,检测磷酸化蛋白时建议用 BSA 作为封闭剂。
3、如果一抗/二抗浓度太高,出现非特异性结合,洗涤也无法完全去除,建议设置多个抗体稀释梯度,从而筛选出合适的抗体比例。
■ 古怪二:斑点
萌 Cece 分析:
封闭液中出现了不溶性物质。
措施:
建议将封闭液充分溶解后进行过滤。
■ 古怪三:最头疼的,没有按照预期结果出现令人满意的条带,如:加入 p38 抑制剂,但 p-p38 表达量没有变化。
萌 Cece 分析:
p38 虽然在不同的细胞中广泛表达,但是在没有诱导的情况下,表达量很低。
措施:
为了成功检测到 p38 的表达,建议:
1、使用阳性对照确保实验体系没有问题。
2、根据实验设计与需求使用诱导物 (如 LPS) 提高表达量。
图 2. LPS 处理前后 p38 表达量对比[2]
SB202190 是一种选择性的 p38 MAPK 抑制剂。SB202190 与 p38 激酶的 ATP 袋结合。
图 3. 在 LPS 诱导的情况下, SB202190 抑制 p38 磷酸化水平[3]
SB203580 是一种 p38 MAPK 的选择性抑制剂。SB203580 抑制 p38 活性时,只抑制了由诱导剂 (如 LPS) 引起的 p-p38 增加量,但不改变 p-p38 的基础水平。这是由于 p38 的自身磷酸化,是不受 SB203580 影响的。
SB203580 通过降低下游 MAPKAPK2,HSP27 和 ATF2 磷酸化来调节 p38 MAPK 信号通路。SB203580 通过结合 ATP 结合区来抑制 p38 MAPK 的催化活性,但不能抑制上游激酶对 p38 MAPK 的磷酸化。
图 4. SB203580 作用机制[4]
So,找到了原因咱再来一次就离成功不远啦!阳光耀眼,乐观地,向前走!
除了以上建议外,萌 Cece 还有一些超实用法宝:
1、在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制剂 (HY-K0011,HY-K0010)。
2、检测磷酸化蛋白时,加入磷酸酶抑制剂 (HY-K0021,HY-K0022,HY-K0023)。
3、建议使用 RIPA 裂解液 (强) (HY-K1001)。
4、转膜结束后,使用丽春红染色确认转膜效果。
5、选用高灵敏度的 ECL 发光液, 特超敏 ECL 化学发光试剂盒 (HY-K1005)。
参考文献
1. Dae-Eun Jeong, et al. Western Blot Analysis of C. elegans Proteins. Methods Mol Biol. 2018; 1742: 213-225.
2. Weiju Wang, et al. Role of TLR4-p38 MAPK-Hsp27 signal pathway in LPS-induced pulmonary epithelial hyperpermeability. BMC Pulm Med. 2018 Nov 27; 18(1): 178.
3. Yong Li, et al. Mogroside V inhibits LPS-induced COX-2 expression/ROS production and overexpression of HO-1 by blocking phosphorylation of AKT1 in RAW264.7 cells. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2019 Apr 1;51(4):365-374.
4. Gopinathan Pillai Sreekanth, et al. SB203580 Modulates p38 MAPK Signaling and Dengue Virus-Induced Liver Injury by Reducing MAPKAPK2, HSP27, and ATF2 Phosphorylation. PLoS One. 2016 Feb 22; 11(2): e0149486.
MCE | 打破 Western Blot 玄学操作相关推荐
- 【实验技术笔记】Western Blotting 实验操作要点及数据分析
文章目录 1. 样品制备 2. SDS-PAGE 胶制作及电泳分离 2.1 灌胶 2.2 电泳分离 3. 转膜 4. 抗体杂交 5. 图像分析 6. 常见问题分析 1. 样品制备 ① 裂解: ◆ 细胞 ...
- Western blot 技术
(western blot) 印迹技术 一般是你先实验进行了一个电泳,然后把电泳后的产物(如DNA.蛋白质)通过印迹技术转移到一个膜上,然后使用特异性的能识别此产物的探针或者抗体来识别,从而检测产物. ...
- Western Blot
Western Blot Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分 ...
- WB(Western Blot)显色方法怎么选?
前面我们已经对Western Blot实验中经常遇到的问题进行总结,问题涉及到WB的各个步骤.其中,封闭和一抗的选择余地不大,二抗的作用是信号扩增,是根据一抗的标记形式而定的.对于无标记一抗,可以选择 ...
- 12bit的图像如何向8bit转化_干货分享 | 如何鉴别Western Blot图像的真实性?
鉴于在有些已发表的学术论文中,部分Western blot结果被认为存在不正当修饰,产生了诸多负面影响.那么,作为PI,如何才能识别自己实验室的WB图片是否存在不正当修改的情况,或证明完美实验结果的真 ...
- Jackson关于Western Blot、IHC 和 ELISA 的显色检测分析
前言: 显色底物用于比色检测.它们简单易用.适用于大多数免疫技术--从免疫组织化学到蛋白质印迹和 ELISA,它们提供了一种J具成本效益的检测方法. 这期的主题是Jackson ImmunoResea ...
- 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )实验检测服务
简介 广州如期生物有限公司提供WB蛋白质印迹法(Western blot)检测服务.蛋白质印迹法是一种用于识别特定蛋白质的生物技术.这种技术通常用于研究蛋白质的表达水平,以及蛋白质的组学研究和生物学研 ...
- WB蛋白质印迹法(Western blot)
蛋白质印迹法(免疫印迹实验)即Western Blot.它是分子生物学.生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法.用于样品特定蛋白在样品中表达相对表达量进行检测. 1.实验流程 2.实验周期及交付结果 ...
- western blot蛋白条带灰度值扫描——python
一.原理与思路 图像由无数的像数构成,python读取图片每一像数点的灰度值,从黑-白的灰度值为0~255,即越黑的地方灰度值越小,越白的地方灰度值越大.显然,我们希望越黑的地方灰度值越大,因此需要做 ...
- 小分子蛋白Western blot 检测
实验概要 1.目的 检测小分子蛋白抗体 2.适用范围 单克隆抗体和多克隆抗体 实验原理 将经电泳分离的抗原转印到膜上作为固相,利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体 主要试剂 试剂配制 ...
最新文章
- 【Cocosd2d实例教程四】Cocos2d实现人物原地走动
- Imageloader2-整体思路
- java(7)——+=的妙用
- 1029 C语言文法定义
- Electron开发入门
- 将devexpress中控件添加到vs工具箱中
- 温故知新,.Net Core遇见WinForms客户端窗体框架,在DotNet Core大一统基础上老树发芽...
- String类的常见方法的使用案例
- Redux Toolkit 使用指南
- Ubuntu搭建饥荒服务器教程
- 2016 server win 假死_win10程序假死无响应的两种解决办法
- 2分钟入侵网站全程实录
- 数据分析-PART1--数据获取和步骤
- 二叉树基础题(五):二叉树的下一个节点最低公共祖先节点
- 产品经理:能不能让这串数字滚动起来?
- android 绑定服务 解绑服务,安卓案例:绑定和解绑服务
- Edge的新标签页设置
- 证券交易金融知识学习(1)
- yxc_第一章 基础算法(一)
- linux中ll和ls的区别,分别是什么意思?
热门文章
- 运行“travel[org.apache.tomcat.maven:tomcat7 maven plugin:2.1:run]时出错:未指定项目JDK
- Python统计学11——分位数回归
- springCloud使用redis报错,Could not resolve type id xxxxx(类全路径名) into a subtype
- 全面图解路由器接口及连接
- 电容滤波器和电感滤波器详解(工作原理,设计详解,典型电路图)
- 09-线程池与进程池
- 【24计算机考研】备考前必须了解的避坑小知识,建议收藏
- 计算机考研的初试和复试的区别,考研初试和复试之间的区别
- MySQL设计一个图书馆数据库_设计一个图书馆数据库
- 【V-REP自学笔记(六)】基于V-REP逆运动学模块的机械臂轨迹规划