Nature：复杂菌群空间分布研究

Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities

（图1：文章信息简介。图片来源：截图）

Article, 2020-12-02

Nature,[IF 42.778]

doi: 10.1038/s41586-020-2983-4

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-020-2983-4

第一作者：Hao Shi

通讯作者：Hao Shi;Iwijn De Vlaminck

主要单位：美国纽约伊萨卡康奈尔大学Nancy E. and Peter C. Meinig生物医学工程学院（Nancy E. and Peter C. Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, Ithaca, NY, USA）

摘要

Abstract

由于环境菌群物种密度大、多样性高，以及光学成像技术的局限性，实现原位绘制复杂微生物群落高系统发育分辨率和空间分辨率的生物地理图谱是一项重大挑战。在此研究人员介绍了全新的高系统发育分辨率微生物组绘图荧光原位杂交技术(HiPR-FISH)，这是一种使用二进制编码、光谱成像和机器学习解码创建复杂群落中数百个微生物物种的位置和身份的微米尺度地图的多功能技术。研究人员发现10位HiPR-FISH可以区分1023个用独特的二元条形码荧光标记的大肠杆菌。HiPR-FISH结合自动探针设计和自定义的单细胞图像分析算法，揭示了抗生素治疗对小鼠肠道微生物组空间网络的破坏，以及人类口腔菌斑微生物组空间结构的稳定性。HiPR-FISH与超分辨率成像相结合，展示了人类口腔微生物中核糖体的不同组织策略。HiPR-FISH提供了一个以单细胞分辨率分析环境微生物群落空间生态的框架。

引言

Introduction

自然环境中分布着大量体积微小，种类、数量繁多的微生物，它们因为各自独特的生存方式和相互作用关系构成一定的空间分布结构。了解生态系统中菌群的空间分布有助于研究各种细菌的生理功能以及菌群之间、菌群和宿主之间的相互作用关系。

目前研究菌群空间分布的核心技术是荧光原位杂交技术，这项技术通过荧光标记的特异性寡核苷酸探针与固定样品中的DNA或RNA结合显示菌群的位置分布[1]。由于每条探针仅标记一种荧光基团与细菌直接结合，并且能够同时成像的荧光基团数量有限，空间定位的菌群谱系分辨率低，极大地限制了复杂菌群多菌种同时定位的研究。尽管之前有研究[2]使用多荧光基团组合标记结合光谱成像的方法，使用八种荧光基团组合标记的方式在人类牙菌斑生物膜样本中15个类群进行成像分析，一定程度上突破了技术障碍，但这种方法仍然不足以应对复杂环境中大量菌群的定位研究，同时由于需要设计合成大量荧光基团标记的探针，成本高、过程繁琐。迄今为止的肠道菌群空间分布研究大多是定性研究，少量定量研究的分析方法都十分粗糙，并且这些方法不能提供单细胞水平的空间信息。

基于以上的研究背景和存在的问题，在Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities这篇文献中，研究人员提出了一种通过二进制编码、光谱成像、机器学习解码的高谱系分辨率定位菌群的荧光原位杂交技术（HiPR-FISH），这种技术能够在微米尺度上创建复杂群落中数百个微生物物种的位置和身份地图，同时实现单细胞定量检测[3]。

（图2：HiPR-FISH方法流程图，图片来源：参考文献[1]）

原理简介

为了使尽可能少的荧光基团同时标记尽可能多的细菌，研究人员首先对十种荧光基团进行二进制编码。有或无某种荧光基团对应二进制编码中的1或0：存在某种荧光基团记为1，不存在记为0.以ABC三种荧光基团二进制编码组合为例，排除一种荧光基团都没有结合、无法成像的组合，三种荧光基团一共能组合出2³-1=7种组合方式。同样地，十种荧光基团能够组合出2¹⁰-1即1023种荧光基团的组合方式，使用这些各不相同的已知荧光基团组合就能区别标记不同的细菌。这1023种组合方式中，有的只有1种荧光基团，有的有5种，有的10种都有。由于每种荧光基团的发射光谱不同，每一种独特的荧光基团组合成像的光谱各不相同，最终可以根据这唯一的光谱解析出对应的细菌种类。

（图3：荧光基团的二进制。图片来源：自制）

为了增加一条探针同时标记的荧光基团的数量，研究人员采用了两步杂交的策略。他们在设计探针时在特异性序列两端加上了侧翼序列，侧翼序列能与荧光基团标记的读出序列杂交，使得一条探针上能够同时结合两个荧光基团。

（图4：两步杂交法，图片来源：参考文献[1]）

荧光基团的组合不止有一种荧光基团，研究人员设计探针时在同一条特异性靶向某种菌种的寡核苷酸序列两端加上不同的读出序列，使不同的读出序列组合与特定的物种相对应。又由于一条寡核苷酸探针上最多只能标记两种荧光基团，为了实现在细菌中标记多种荧光探针，研究人员利用了细菌体内分布着大量的核糖体这一特性，并且在实验中研究人员也通过光子计数测量的方法估算出每个细菌中约有1000个核糖体，保证多种靶向同一细菌的不同侧翼修饰序列的探针能够随机、等比例地与细菌结合。

（图5：HiPR-FISH方法流程图，图片来源：参考文献[4]）

两步杂交的过程可简述为：

1.为每个目标菌种合成一系列具有细菌特异性但读出序列不同的探针，保证每一个细菌有唯一的读出序列组合

2.使用经过DNA侧翼序列修饰的菌群特异性探针进行杂交

3.使用荧光标记的读出探针与侧翼序列结合

4.光谱成像，产生唯一的光谱图

在光谱成像时，研究人员使用五个波长的激光器同时单轮成像，通过激光共聚焦显微镜在五分钟内实现单个视野的拍照。不同荧光基团同时成像得到的光谱图是不同读出探针的波峰叠加形成的波谱图。例如有R1和R2两种读出探针，最后得到的光谱图是R1和R2读出序列形成的波峰组合出独特的波谱。

（图6：荧光基团发射光谱，图片来源：文献截图）

获得光谱之后，通过统一流形近似与投射的降维技术，获得一组主变量来减少所考虑的随机变量数量，实现数据可视化。再使用支持向量机这种学习算法，对数据分类和回归，解析出光谱对应的二进制代码，获取菌群的谱系信息。

（图7：光谱解析，图片来源：文献截图以及自制）

为了进一步研究菌群的空间分布情况，研究人员开发了一种区域临界增强(LNE:local neighbourhood enhancement)的算法，LNE利用像素的局部邻域信息将每个像素作为单元或背景的一部分进行分类，对细菌边界进行分割，增加复杂菌群成像中单个细菌的分辨率。

（图8：区域临界增强算法，图片来源：文献截图）

技术流程

高谱系分辨荧光原位杂交技术的实验流程为对复杂菌群样本进行16S PCR扩增测序，通过测序结果设计并合成探针，随后将固定的样本与探针特异性杂交，再与读出序列杂交，光谱成像，最终对成像结果进行定量分析，获得细菌形态、大小以及空间分布等信息。

（图9：HiPR-FISH实验流程，图片来源：文献截图）

结果

Results

研究人员首先给算法创造一个训练集，保证算法能够根据训练集获取的数据正确地预测实验样本中不同菌群的分类情况以及空间分布信息。研究人员对大肠杆菌标记了1023个不同的条形码（图10:b,c），创建所有条形码菌株在相同浓度下的混合物，随后进行成像（图10:d），并对总共65,534个细胞进行了条形码解码。该分类器提取实验测量光谱的均值和协方差，利用多变量正态分布模拟参考光谱（图11:e）。后续实验中对于复杂菌群的光谱解析均参照训练集模拟出的参考光谱。

（图10：大肠杆菌光谱成像，图片来源：文献截图）

随后研究人员对这1023个标记不同条形码的大肠杆菌随机分组，并测量了每组的单细胞光谱，量化了每种混合物中不同条形码的相对丰度，最后发现，所有组的测量丰度和输入丰度非常接近，中位数斜率为0.95，平均R²为0.83(图11:f)。

在大肠杆菌中验证了方法的可行性之后，研究人员对11种细菌进行了探针设计和成像。同时，他们生成了最简单、最复杂和随机选择的ABC三组探针，读出序列组合由更多的荧光团组成被认为是更复杂的。每组探针靶向菌群中11个物种的特异性杂交序列是一样的，只是侧翼编码的序列不同。为了评估每个定制的物种特异性探针的特异性，研究人员记录了每个探针与物种组合的单细胞光谱。结果发现最简单、最复杂和随机选择的条形码物种组合的指定条形码和预期条形码之间有很强的一致性（图11:g）。至此研究人员表示他们发现使用HiPR-FISH可以实现菌种特异性检测和灵活的二进制编码。

（图11：HiPR-FISH方法验证，图片来源：文献截图）

抗生素处理小鼠肠道菌群空间分布研究

接下来研究人员使用HiPR-FISH在人体复杂菌群中研究菌群的空间分布情况。抗生素治疗对黏膜相关肠道微生物组空间组织的影响尚未得到详细研究，于是研究人员首先在有无抗生素治疗的情况下绘制了小鼠肠道微生物组的HiPR-FISH图谱(图12:c)。研究人员设计了两组探针，包括115和264个探针，靶向47个属，并再次使用这些探针集来测试HiPR-FISH的可靠性。研究人员比较了多个视野和不同组织切片的每个条形码测量的荧光强度，发现所有条形码测量的总强度之间存在很强的相关性，这表明探针杂交和成像是可重复的。接下来，研究人员将HiPR-FISH成像结果与同一蜡块包埋的组织的宏基因组测序结果进行比较，发现成像和测序测量结果一致。

在使用克林霉素处理的小鼠结肠中，研究人员从空间定位图谱中解析出Bacteroides, Macellibacteroides 和 Longibaculum,实现了复杂菌群成像中单个菌种的定位。并计算了肠道中两个常见菌属拟杆菌属和毛螺菌属的径向分布函数（PCF: pair correlation function），实验结果表明拟杆菌PCF缓慢衰减，表明拟杆菌在近距离(3.3μm左右)形成簇状(图12:d)。而helellia的PCF保持不变，表明毛螺菌是随机分布的。接下来研究人员测量了细菌到粘膜边界的距离，与之前观察结果一致的是拟杆菌在粘膜边界附近富集(图12:e)。研究人员也对粪球末端区域进行了大面积平铺扫描，发现粪球表面覆盖着一层致密的微生物(图12:f)，即使在与宿主上皮组织没有明显接触的位置也是如此。最后，他们生成了z-stack的体积渲染图像(图12:g)。

（图12：克林霉素处理小鼠结肠菌群成像，图片来源：文献截图）

接下来，研究人员检查了在环丙沙星处理后，任何两个类群之间的物种丰度和物理接触数量的变化(图13:a)。实验结果表明拟杆菌门(Bacteroidetes) /厚壁菌门(Firmicutes)与对照组小鼠比较的比率增加(图13:b)，这与之前研究一致。与环丙沙星处理相关的Shannon多样性有小幅但显著的增加(独立t检验，双尾P = 0.002)(图13:c)。环丙沙星处理小鼠和对照组小鼠的细胞小斑块β-多样性随着斑块大小的增加而减少(图13:d)。为了检查局部成分的变化，研究人员计算了小块细胞之间的Bray-Curtis差异。Bray-Curtis不相似性随斑块中心距离的增加而增加，但在较大距离时仍然很小(图13:e,f)。

（图13：环丙沙星处理小鼠结肠菌群成像，图片来源：文献截图）

人类口腔微生物群空间分布研究

口腔微生物群是存在于人类的最多样化的微生物群之一，包括600多种普遍存在的菌种。研究人员在27个月的过程中，对健康供体在7个时间点收集的菌斑生物膜进行HiPR-FISH(图14:a).首先使用HiPR-FISH流程，设计了靶向54个菌属，由233个探针组成的探针组合。在成像结果中观察到与之前的观察结果一致的，由链球菌组成的玉米芯状结构(图14:c)。口腔生物膜中的微生物群落似乎比小鼠肠道中的微生物群落更具空间结构(图14:b)。我们在纵向样本中观察到具有显著形态的周期性微架构，如Lautropia细胞簇(图14:d)，这表明口腔微生物组的空间结构随时间保持稳定。为了更详细地研究这一点，研究人员测量了细胞斑块间的Shannon多样性和Bray Curtis差异作为时间函数，发现两者在纵向上是稳定的(图14:e, f)。口腔微生物组的Bray Curtis差异性高于小鼠肠道微生物组的Bray Curtis差异性，支持视觉评价，口腔微生物组比肠道微生物组更有空间组织。β-多样性也遵循类似的趋势(图14:g)。为了检验不同微生物类群间空间相互作用的纵向稳定性，研究人员计算了每个时间点的聚合空间邻接矩阵，并确定了Frobenius矩阵距离作为网络相似性的度量。在所有时间点测量的空间关联网络比具有相同类群丰度的随机网络更相似，再次表明口腔微生物群落结构随着时间的推移是稳定的(图14:h)。

（图14：人体口腔菌苔菌群成像，图片来源：文献截图）

接下来，研究人员进一步关注了之前没有原位环境中可视化微生物群落和感兴趣的菌种。他们发现了一个由假丙酸杆菌、心杆菌和Schwartzia组成的健康口腔微生物群（图15:i）。以及之前没有被定位研究的菌属，Lachnoanerobaculum与以往研究报道的形状相同，并且从Lachnoanerobaculum 和 Prevotellamassila的位置关系可以推测它们可能具有代谢相关性（图15:j）。最后通过将HiPR-FISH与超分辨率成像结合起来，将系统发育信息与核糖体组织联系起来，揭示了口腔微生物组中不同类群所表现出的细胞内核糖体组织的不同策略（图15:k）。

（图15：人体口腔菌苔未知菌群成像，图片来源：文献截图）

讨论

Discussion

在本研究中，研究人员介绍了一种绘制复杂菌群空间分布图谱的多功能工具HiPR-FISH.与现有的方法相比，HiPR-FISH在鉴定菌种数量方面提高了十倍以上。HiPR-FISH使用了一种以前被用来在组织中空间绘制mRNA分子图谱的两步杂交方案[5]。这种策略，结合在微生物细胞中高丰度和相对均匀分布的16S rRNA分子，使标记细菌细胞的组合多达10个荧光团。HiPR-FISH在商用共聚焦显微镜上只需要一次成像。单个视野可以在5分钟内成像，比依靠连续杂交和成像的FISH程序更快。

HiPR-FISH能够应用于需要快速获取数据的项目，如可用于诊断传染病。HiPR-FISH可为研究肠道、口腔或植入设备上的复杂微生物种群开辟道路；也可用于研究肠道相关疾病，如炎症性肠道疾病。此外，HiPR-FISH将有助于分析微生物群在上皮屏障表面形成的肿瘤(如结直肠癌)的起始和进展中的作用。最后，HiPR-FISH的定量单细胞测量将是测试软物质理论的有用资源，这些理论控制着微生物群落的组合。

参考文献

1.       Nguyen, J. and C. Tropini, Bacterial species singled out from a diverse crowd. Nature, 2020. 588(7839): p. 591-592.

2.       Valm, A.M., et al., Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(10): p. 4152-7.

3.       Shi, H., et al., Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature, 2020. 588(7839): p. 676-681.

4.       Shi, H., et al., Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. 2020. 588(7839): p. 676-681.

5.       Moffitt, J.R. and X. Zhuang, RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization (MERFISH). Methods Enzymol, 2016. 572: p. 1-49.

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