撰文  |  同同

涉及植物研究的小伙伴们应该对于真菌植物共生都有所了解，根瘤菌和大豆的共生就是教科书级别的经典案例。植物与真菌的共生作为农业生产中一种重要的共生关系，一直是农业科研工作者的研究热点。由于自然环境下的植物是具有本能的防御能力的，这就对共生真菌的寄生制造了很大的阻碍。因此，人工介导的真菌侵染寄主植物以达到共生的技术顺应而生。

早在1985年就有研究者通过将菌丝体放入分生组织的切口中来实现真菌对于植物的侵染。近年来，这种方法已被广泛用于分子水平上的真菌植物共生研究。但是，目前尚无用于评估接种后早期真菌感染反应的综合方案。近日，来自新西兰北帕默斯顿草原研究中心的Damien J. Fleetwood团队以“Histological Methods to Detect Early-stage Plant Defense Responses during Artificial Inoculation of Lolium perenne with Epichloë festucae”为题发表在Bio-Protocol上的最新研究表明，真菌感染植物时会出现四种重要反应，包括细胞死亡、胼胝质沉积、木质素产生和过氧化氢 (H₂O₂) 产生。这些生理指标对于在非常早期的时间点确定宿主对感染的反应是非常有用的。

原文链接：https://bio-protocol.org/e4013

简单来说，为应对入侵的微生物，植物的早期行动之一是产生不同类型的活性氧 (ROS)，其中H₂O₂，它作为一种抗菌剂保护植物免受入侵微生物的侵害，是最早的信号之一，并且诱导植物的其他反应[1]。此外，通过沉积胼胝质和木质素，植物在感染部位重塑细胞壁以阻止真菌入侵[2-3]。作为晚期防御反应，感染部位周围的植物细胞会经历程序性细胞死亡（过敏反应），以限制入侵微生物的可用食物[4]。所以我们只需检测这四个生理指标便可以知道真菌是否成功侵染寄主植物了。

第一步，胼胝质沉积的染色，作者采用苯胺蓝染色方法[5]。这是一种经典且快速的方法，只需配制适合浓度的苯胺蓝染色液，室温下染色约30 min，即可用荧光显微镜观察，一般根据荧光强度的强弱来判断胼胝质沉积量的多少。本文中涉及的染色试验均选择7日龄的幼苗进行接种，接种后4天进行染色，且对照组设置切口植物和未切口植物两种。首先，在幼苗接种后4天进行胼胝质染色，染色结果如图所示，A图中空白对照组未检测到荧光，Impatiens walleriana花粉管作为阳性对照可检测到较强黄绿色荧光，B图中对照组同样没有检测到荧光，实验组中检测到较强黄绿色荧光。黄绿色荧光的强度表征菌株是否成功侵染寄主植物。

图1. 胼胝质沉积的染色

第二步，木质素沉积的染色，作者使用了番红素溶液染色法，染色结果见图2。番茄红染液无法对未切口的植物染色，但可对切口的植物染色。实验组接种突变体菌株和野生型菌株的植物有较深染色，即产生大量木质素，用于判定植株成功接种植物。

图2. 木质素沉积的染色

第三步，观察死亡的细胞，作者使用了台盼蓝染色法，染色结果见图3，接种野生型菌株还是突变体菌株的植物均呈现大面积的深蓝色。通过台盼蓝染色的深浅即可判断植物细胞的死亡程度，同时判定菌株是否成功接种植物。

图3. 台盼蓝染色

第四步，H₂O₂染色，最常用的是DAB染色法。该方法基于可视化3,3'-二氨基联苯胺(DAB)被H₂O₂氧化后的颜色变化，染色结果见图4。实验组接种突变体菌株的植物产生的黑褐色沉淀显著多于接种野生型菌株的植物。通过DAB染色的深浅即可判断植物体中H₂O₂的积累情况，同时判定菌株是否成功接种植物。

图4. H₂O₂染色

实 验 Tips

1. 为保证实验的准确性，每个处理条件下的植物，最少保证有5个生物学重复。

2. 生理指标的染色试验要因“植物”制宜，不同的植物或不同部位的组织，在染色时间上可能存在差异，当通用Protocol不能获得很好的结果时，要考虑是否要适当调整染色条件。

3. 染色后的植物组织均需要在显微镜下观察，为了保证拍出的照片和实际情况更接近，需要不断调整显微镜光强和曝光时间以达到最佳的效果。

4. 这四个生理指标并不局限于本实验，很多实验中均可以使用。比如，生物胁迫或者非生物胁迫均会诱导H₂O₂的产生，当你想判断植物生长状况是否正常时，测试下H₂O₂染色便知。再比如，拟南芥在低磷胁迫的条件下，主根生长受到严重抑制，此时根尖中H₂O₂，胼胝质均有大量沉积。所以，小伙伴们看事情不要太局限哦，实验也是一通百通的。

参考文献

[1] Walters, D. R. (2003). Polyamines and plant disease. Phytochemistry 64(1): 97-107.

[2] Luna, E., Pastor, V., Robert, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. and Ton, J. (2011). Callose deposition: a multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe Interact 24(2): 183-193.

[3] Zipfel, C. (2009). Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Curr Opin Plant Biol 12(4): 414-420.

[4] Lo Presti, L., Lanver, D., Schweizer, G., Tanaka, S., Liang, L., Tollot, M., Zuccaro, A., Reissmann, S. and Kahmann, R. (2015). Fungal effectors and plant susceptibility. Annu Rev Plant Biol 66: 513-545.

[5] Knox, R. B. (1979). Pollen and allergy. Studies in Biology. No. 107. Arnold, London.

Bio-protocol 简介

Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。Bio-protocol期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，Bio-protocol已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的近4000篇实验方案，并且同 Science、eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年Bio-protocol期刊已被PubMed Central，ESCI收录。

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